Предшественники лука: Лучшие предшественники для лука и чеснока | Твоя усадьба

Один из самых интригующих вопросов об ароматических соединениях — их роль в Allium s. Уровни небелковых производных цистеина и глутатиона составляют 1–5% от сухого веса (Lancaster and Kelly, 1983), что указывает на то, что это основная биосинтетическая активность в растении.Две роли, которые были приписаны, заключаются в защите от вредителей и хищников, особенно в зимующей луковице, и в хранении и транспортировке углерода, азота и серы (Lancaster and Boland, 1990). Было проведено обширное исследование антимикробных свойств экстракта Allium in vitro , рассмотренного Анкри и Мирельманом (1999), но существует меньше примеров in vivo , особенно исследований, посвященных тому, как ароматические соединения передают преимущество луку . с.Устойчивость к болезням не была приоритетом при селекции современных коммерческих сортов лука, поэтому трудно оценить влияние вкусовых соединений (Б. Смит, личное сообщение). В целом, как сообщается, лук с мягким вкусом хуже хранится.

Однако несколько видов насекомых и грибов приобрели специальные взаимодействия с Allium s, где летучие ароматические вещества являются аттрактантами для специализированных питателей и патогенов. Полевые эксперименты на Sclerotium cepivorum Berk.возбудитель белой гнили, одного из наиболее экономически значимых грибковых заболеваний лука и чеснока, показал сильную зависимость от присутствия летучих ароматизаторов для прорастания склероций (Coley-Smith, 1986). Точно так же луковая моль Acrolepiopsis Assectella Zeller и луковая муха Delia antiqua Meigen привлекаются к своим соответствующим растениям-хозяевам летучими ароматическими веществами (Romeis et al. , 2003). В случае белой гнили нет действительно устойчивых сортов лука, и экспериментальное заражение может быть затруднено.Частично эта изменчивость может быть связана с луком, но также с условиями окружающей среды и грибком (Earnshaw et al. , 2000).

Одно интересное наблюдение о роли предшественников аромата было получено в эксперименте Паркина и Томаса (1996) по влиянию элиситоров на уровни предшественников аромата при дифференциации культур каллуса лука. Элиситоры, являющиеся фрагментами патогенов растений, тканями растений или сигнальными молекулами, могут запускать продукцию защитных соединений при их представлении в тканевых культурах (Collin, 2001).В их экспериментах фрагменты клеточной стенки лука и грибов, а также сигнальная молекула салициловой кислоты подавляли выработку предшественников аромата. Это противоположно тому, что можно было бы ожидать, если ароматические соединения участвуют в защите растений.

Биосинтез предшественников ароматизаторов

Исследование биосинтеза ароматических соединений Allium началось с открытия Столлом и Зеебеком (1947) того факта, что ACSO присутствует в тканях чеснока в качестве стабильного источника диаллилтиосульфината (аллицина), основного летучего ароматизатора.Они продемонстрировали, что для превращения ACSO в аллицин требуется фермент аллииназа. Еще два производных сульфоксида цистеина, MCSO и PCSO, были идентифицированы в луке Виртаненом и Матиккала (1959), а четвертый сульфоксид цистеина, PeCSO, вскоре был идентифицирован в луке (Virtanen and Spåre, 1961). Также стало очевидно, что Allium s содержат значительные количества γ-глутамилпроизводных этих соединений (обзор в Whitaker, 1976).

Ланкастер и его коллеги предложили путь (Lancaster and Shaw, 1989; Lancaster et al., 1989; Randle et al. , 1995), требуя γGP в качестве промежуточных продуктов, что стало принято в качестве биосинтетического пути (Block, 1992; Prince et al. , 1997). Путь основан, главным образом, на исследованиях радиоактивной метки и анализе тканей Allium . Он предполагает (рис. 1A), что биосинтез предшественников ароматизаторов в Allium s происходит через S -алк (эн) илилирование цистеина в глутатион с последующей транспептидацией для удаления глицильной группы, окислением до сульфоксида цистеина. и, наконец, удаление глутамильной группы с образованием CSO.Этот путь имеет параллели с деградацией глутатиона (Leustek et al. , 2000), что будет обсуждаться позже. Альтернативный путь биосинтеза (рис. 1B) исключает глутатион в пользу прямого алк (ен) илилирования цистеина или тиоалк (ен) илилирования O- ацетилсерина с последующим окислением до сульфоксида. Это также имеет параллели в производстве нескольких вторичных метаболитов, опосредованных цистеинсинтазой (CS, EC 4.2.99.8, также известной как O -ацетилсеринтиоллиаза) (Ikegami and Murakoshi, 1994).В обоих путях были подробно изучены некоторые из предложенных биосинтетических ферментов из Allium s, и их роль была выведена из других систем. Относительный вклад обоих путей во всех тканях и на протяжении всей истории жизни также неясен, и источник алк (ен) ильных групп еще предстоит выяснить.

Рис. 1.

Два предложенных пути синтеза предшественников ароматизатора Allium , показанные для синтеза сульфоксида метилцистеина.Предполагается, что биосинтез других предшественников протекает аналогично, но с участием другого донора алк (ен) ила. (адаптировано из Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989). Путь A (слева) иллюстрирует участие глутатиона, который метилируется, а затем за счет потери глицина, окисления и, наконец, потери γ-глутамильной группы, превращающейся в метилцистеинсульфоксид. Путь B показывает альтернативный путь через прямое метилирование O -ацетилсерина с образованием метилцистеинсульфоксида.

Рис. 1.

Два предложенных пути синтеза предшественников ароматизатора Allium , показанные для синтеза сульфоксида метилцистеина. Предполагается, что биосинтез других предшественников протекает аналогично, но с участием другого донора алк (ен) ила. (адаптировано из Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989). Путь A (слева) иллюстрирует участие глутатиона, который метилируется, а затем за счет потери глицина, окисления и, наконец, потери γ-глутамильной группы, превращающейся в метилцистеинсульфоксид.Путь B показывает альтернативный путь через прямое метилирование O -ацетилсерина с образованием метилцистеинсульфоксида.

Одна техническая проблема в экспериментах с использованием поврежденных тканей Allium , таких как разрезанные листья или сегменты луковиц, заключается в том, что аллииназа высвобождается и может расщеплять вновь образованные предшественники аромата. Кроме того, пептидазы и γ-глутамилтранспептидазы (EC 2.3.2.2) присутствуют в тканях лука и чеснока (Lancaster and Shaw, 1991; Ceci et al., 1992; Hanum et al. , 1995), предоставляя дополнительные возможности для обмена между биосинтетическими промежуточными продуктами предшественников ароматизаторов. Это может объяснить некоторые расхождения в результатах между разными исследовательскими группами. Некоторые исследования пытались избежать повреждения тканей, отслеживая поступление ³⁵ S-сульфата в корни проростков или прорастающих луковиц. Другая стратегия использует культуру ткани, где тонкая кутикула позволяла вводить потенциальные биосинтетические промежуточные продукты в неповрежденные, но недифференцированные клетки.

Роль γ-глутамилпептидов в биосинтезе предшественника ароматизатора

Lancaster and Shaw (1989) исследовали биосинтетические отношения между γGP и CSO, проследив судьбу короткого импульса ³⁵ S-сульфата в листьях, вырезанных из проростков лука, прорастающих зубчиков чеснока и луковиц декоративного Allium siculum. . Это исследование легло в основу предположения, что γGP являются промежуточными продуктами биосинтеза CSO.Глутатион, γ-глутамилцистеин, γ-глутамилпропенилцистеинсульфоксид, метилглутатион и S -2-карбоксипропилглутатион, наряду с несколькими неидентифицированными соединениями, были помечены в течение первых 15 минут, в то время как для радиоактивной метки потребовалось 6 часов. появляются в ОГО. Хотя на протяжении всего эксперимента в глутатионе было обнаружено некоторое количество ³⁵ S, радиоактивная метка не была обнаружена в γGP после первого дня. В листьях лука MCSO вела себя иначе, чем PeCSO и PCSO, в том смысле, что количество метки оставалось неизменным при измерениях, проведенных через 7 дней, тогда как в PeCSO количество меток увеличилось к этому времени в 8 раз, а в PCSO — в 5 раз. ³⁵ S-меченный S -2-карбоксипропилглутатион был обнаружен в луке и чесноке, но не в A. siculum .

Таким образом, импульс радиоактивной серы был включен сначала в глутатион и γGP, а затем в CSO. Появление меченного радиоактивным изотопом сульфата в глутатионе не является неожиданным, поскольку сульфат ассимилируется в цистеин, и было подсчитано, что одна треть этого количества немедленно направляется в реакции цикла глутатиона. Хотя MCSO присутствует в луке и чесноке, он был основным предшественником вкуса, обнаруженным в A.siculum Ланкастера и Шоу (1989). Присутствие меченого S -2-карбоксипропилглутатиона в луке и чесноке, но не A. siculum , позволяет предположить, что он является промежуточным звеном в биосинтезе аллильной, пропенильной и пропильной групп CSO (рис. 2), в согласии с Гранротом (1970). Аналогичное исследование (Эдвардс и др. , 1994) с использованием интактных наборов прорастающего лука показало, что характер включения отличался в неповрежденных тканях, при этом большая часть радиоактивности происходила в CSO с небольшим указанием на то, что метка была в γGP. до входа во фракцию CSO.Различия, наблюдаемые в ходе этих двух исследований, могут быть вызваны метаболическими различиями между интактными растениями и отделившимися стареющими листьями. Эти эксперименты, тем не менее, предоставили убедительный путь биосинтеза и объяснение взаимосвязи между несколькими соединениями серы, обнаруженными в Allium s. Однако биосинтез в разных тканях и состояниях развития, происхождение алк (ен) ильных групп, а также взаимосвязь между CSO и γGP требуют дальнейшего изучения.

Рис. 2.

Предлагаемый путь биосинтеза аллильных, пропенильных и пропильных групп предшественников ароматизатора Allium (адаптировано из Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989). Показанный путь демонстрирует, как метакрилат может быть преобразован в аллильную, пропильную или пропенильную группу. Другие промежуточные продукты в биосинтезе предшественников ароматизаторов не показаны.

Рис. 2.

Предлагаемый путь биосинтеза аллильных, пропенильных и пропильных групп предшественников ароматизатора Allium (адаптировано из Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989).Показанный путь демонстрирует, как метакрилат может быть преобразован в аллильную, пропильную или пропенильную группу. Другие промежуточные продукты в биосинтезе предшественников ароматизаторов не показаны.

Происхождение заместителей алк (ен) ила

Цистеин, как известно, химически реагирует с метакриловой кислотой с образованием S -2-карбоксипропилцистеина, обеспечивая таким образом путь к алк (ен) ильным группам в ACSO, PeCSO и PCSO. Гранрот (1970) уже показал, что ¹⁴ C-валин дает радиоактивно меченную метакриловую кислоту, которая может реагировать с глутатионом с образованием S -2-карбоксипропилглутатиона. In vivo , метакрилил-КоА является промежуточным звеном катаболизма валина (Zolman et al. , 2001), обеспечивая источник этого материала внутри клетки. На основании этих данных было сделано предположение, что все алк (ен) ильные боковые цепи в CSO (кроме метильной) были образованы из S -2-карбоксипропильной группы посредством декарбоксилирования и восстановления, как показано на рис. 2. В качестве дополнительных доказательств для этого маршрута in vivo , как Granroth (1970), так и Suzuki et al. (1962) идентифицировал включение ¹⁴ C-валина в S -2-карбоксипропилцистеин и S -2-карбоксипропилглутатион.Кроме того, Гранрот (1970) подтвердил, что лук может гидролизовать S -2-карбоксипропилглутатион и что в ткани листьев лука S -2-карбоксипропилцистеин быстро превращается в PeCSO, хотя и без включения радиоактивной метки в S. -2-карбоксипропилглутатион.

Эксперименты для определения способности лука превращать S -2-карбоксипропилцистеин в PeCSO были также проведены Парри и его коллегами. Мечение атома серы и пропильной группы в S -2-карбоксипропилцистеине показало, что луковые растения превращали его в PeCSO без значительных изменений (Parry and Sood, 1989).Эти эксперименты также предоставили информацию об окислительном декарбоксилировании S -2-карбоксипропилцистеина. Тритий в C-2 карбоксипропильной группы оставался в PeCSO, в то время как тритий в C-3 терялся. Это указывает на то, что производное 3-кето- S -2-карбоксипропилцистеина не является промежуточным продуктом в реакции декарбоксилирования. Последующие эксперименты, в которых S -2-карбоксипропилцистеин стереоспецифически тритировали по C-3, доказали, что конфигурация реакции была такой же, как и при декарбоксилировании, связанном с биосинтезом порфирина и терминального алкена у растений (Parry and Lii, 1991).

Есть признаки того, что включение серы в CSO и окисление до сульфоксида осуществляется ферментами с широкой субстратной специфичностью. Биосинтез цистеина путем добавления серы к O -ацетилсерину требует членов семейства цистеинсинтаз, некоторые члены которого, как известно, играют роль во вторичном метаболизме (Ikegami and Murakoshi, 1994). Хотя цистеин может быть алк (ен) илилирован в составе трипептида глутатиона, есть убедительные доказательства того, что это также может происходить во время синтеза одной аминокислоты.Инкубация листьев лука или чеснока с ¹⁴ C-серином и рядом тиолов (включая этантиол, бензолметантиол и 2-тиоэтанол) приводила к синтезу соответствующих замещенных цистеинов с радиоактивной меткой (Granroth, 1970). В целом согласны с этой работой, эксперименты Turnbull et al. (1981) показал, что проникновение ¹⁴ C-серина и ¹⁴ C-цистеина в прорастающие листья лука привело к включению радиоактивности как в MCSO, так и в PeCSO.Добавление серина и либо 2-пропентиола, либо этантиола к культурам корня лука привело к синтезу ACSO и S -этил CSO (Prince et al. , 1997), ни один из которых обычно не синтезируется луком. Однако наблюдение, что доставка меченного радиоактивным изотопом цистеина в ткань лука (Granroth, 1970) всегда приводила к быстрому образованию PeCSO, предполагает, что это происходит непосредственно из цистеина. Если бы перенос тиоалкила на O -ацетилсерин был единственным источником биосинтеза CSO, то маловероятно, что радиоактивные метки попадут в CSO из цистеина.

Доказательства общей природы стадии окисления получены из нескольких исследований, которые демонстрируют окисление экзогенных S -алк (ен) илцистеинов до соответствующего сульфоксида. Гранрот (1970) показал, что S -метилцистеин, S -этилцистеин, S -пропилцистеин и S -пропенилцистеин могут быть окислены до соответствующего сульфоксида тканью лукового листа. Более поздние эксперименты подтверждают этот вывод. Например, ткани лука, чеснока и лука-пучка были способны преобразовывать S -аллилцистеин в ACSO, даже если эти виды не продуцируют ACSO (Ohsumi et al., 1993), с указанием того, что окисление опосредовано стереоспецифическим ферментом. Оксидаза, предложенная Ланкастером и Шоу (1989) для действия на γ-глутамил- S -алк (ен) илцистеины, может, следовательно, также распознавать S -алк (ен) илцистеины.

Контроль биосинтеза предшественников ароматизаторов: биосинтез в культуре тканей

Путь биосинтеза предшественников ароматизаторов в луке и чесноке, по-видимому, не ограничен определенной тканью или типом клеток.Синтез вторичных метаболитов недифференцированными клетками во многих культурах растительных клеток или тканей обычно намного ниже, чем в интактном растении, но изменение условий роста может стимулировать значительное увеличение урожайности (Collin, 2001). Таким образом, исследования с использованием культур тканей лука и чеснока могут дать представление о том, может ли добавление каких-либо предлагаемых биосинтетических промежуточных продуктов стимулировать этапы биосинтеза CSO. Все исследования показывают, что аллииназа присутствует в культурах тканей лука (Davey et al., 1974), но основные предшественники аромата отсутствуют или присутствуют только в небольших количествах в недифференцированной каллусе. Недифференцированные бесцветные каллусы лука и чеснока содержали менее 10% от уровня предшественников аромата в луковицах и почти полностью содержали MCSO (Селби и др. , 1979; Ланкастер и др. , 1988). Следовые количества PeCSO могут быть обнаружены в каллусе лука после инкубации с ¹⁴ C-цистеином или серином (Turnbull et al. , 1981), что указывает на то, что этот путь биосинтеза был активен только в очень ограниченной степени.Имеются сообщения о низких уровнях ACSO и PCSO в недифференцированном каллусе чеснока (Madhavi et al. , 1991), а также о PCSO и PeCSO в каллусе лука-чеснока (Mellouki et al. , 1996), что позволяет предположить, что Allium виды в культуре ткани могут различаться по биосинтетической способности.

Синтез полного спектра предшественников аромата может возобновиться, если каллусам будет позволено повторно дифференцироваться или восстановить способность к фототрофному метаболизму. Как только каллус чеснока снова дифференцировался в зеленые побеги или корни (Lancaster et al., 1988), ткани содержали ACSO, MCSO и PCSO на уровнях, сопоставимых с интактными растениями. Возобновление синтеза предшественника вкуса после повторной дифференцировки каллуса лука на побеги и корни после удаления ауксина 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4, D) было зарегистрировано ранее Turnbull et al. (1981), а ауксин-4-амино-3,5,6-трихлорпиколиновая кислота (пиклорам) индуцировала PeCSO даже на высоких уровнях, которые подавляли явную дифференцировку (Musker et al., 1988).

Добавление доноров S -alk (en) ила или предполагаемых промежуточных продуктов биосинтеза способствует синтезу CSO в тканевых культурах. Очень низкие уровни MCSO и ACSO были обнаружены в побеговых каллюсах чеснока (90 мкМ CSO по сравнению с 6,0 мМ в луковицах) вместе со следовыми количествами S -аллилцистеина и S -метилцистеина (Ohsumi et al. , 1993), но добавление 2-пропентиола к культуральной среде приводило к обнаруживаемым уровням как S, -аллилцистеина, так и ACSO в течение нескольких часов.Недавние эксперименты в нашей лаборатории также продемонстрировали, что как луковые, так и тканевые культуры чеснока способны синтезировать ACSO, если они снабжены 2-пропентиолом или S -аллил-L-цистеином, и PCSO, когда поставляются с пропилтиолом или S — пропил-L-цистеин (J Hughes, неопубликованная работа). Синтез PeCSO может быть аналогичным образом восстановлен до значительных уровней в культуре каллуса лука с помощью S -2-карбоксипропилцистеина или S -пропенилцистеина (Selby et al., 1980). Потенциальные промежуточные продукты, полученные ранее в пути биосинтеза, не имели такого эффекта. Это предполагает, что отсутствие биосинтеза ароматических соединений в культурах ткани лука происходит из-за ингибирования образования S -2-карбоксипропилцистеина.

Таким образом, имеется экспериментальное свидетельство синтеза CSO, протекающего через алк (ен) илилированный свободный цистеин и через S -алк (ен) илилированный глутатион. Вопрос о том, действуют ли оба пути постоянно во всех тканях, еще предстоит решить, но информация о ферментах, необходимых для обоих путей, могла бы помочь в ответе.

Пептидазы и транспептидазы

Связь между γ-глутамилпептидами и алк (ен) илцистеинсульфоксидами, предложенная Ланкастером и соавторами (Lancaster and Shaw, 1989; Lancaster et al. , 1989; Randle et al. , 1995), где первые являются биосинтетическими предшественниками последнего, требуется активность ферментов по удалению глициловых и γ-глутамильных остатков из возникающего алк (ен) илсульфоксида. γ-глутамилтранспептидаза катализирует перенос γ-глутамильной группы от γ-глутамилпептидов либо к аминокислотам, либо к другим пептидам.Этот фермент может также действовать как γ-глутамилпептидаза, требуя только воды в качестве акцептора. У млекопитающих и микроорганизмов он участвует в «γ-глутамиловом цикле» (рис. 3), который разрушает глутатион и участвует в транспорте цистеина (Noctor et al. , 2002). Обе эти активности были обнаружены в водных экстрактах гвоздики и листьев проросшего сорта чеснока Red (Ceci et al. , 1992). Активность ферментов была выше в быстрорастущих листьях. Активность гамма-глутамилпептидазы была зафиксирована в листьях лука-чеснока и снизилась до 5% от этого уровня в клеточных культурах (Mellouki et al., 1996). Добавление экзогенной пептидазы увеличивало выход аллииназной реакции из культур клеток лука-чеснока, предполагая, что недостаток γ-глутамилтранспептидазы также может быть причиной низких уровней предшественников аромата в культуре тканей.

Рис. 3.

Предлагаемые пути деградации глутатиона у растений и животных. (Адаптировано из Leustek et al. , 2000; Noctor et al. , 1998.) Путь A (слева) указывает на γ-глутамиловый цикл у животных.Путь B (справа) указывает на второй путь, который существует по крайней мере в некоторых растениях.

Рис. 3.

Предлагаемые пути деградации глутатиона у растений и животных. (Адаптировано из Leustek et al. , 2000; Noctor et al. , 1998.) Путь A (слева) указывает на γ-глутамиловый цикл у животных. Путь B (справа) указывает на второй путь, который существует по крайней мере в некоторых растениях.

Активность γ-глутамилпептидазы была обнаружена в листьях, корнях и луковицах растущего лука, но не в спящих луковицах разновидности Саутпорт Уайт Глоб (Lancaster and Shaw, 1991).Однако он был обнаружен в хранящихся луковицах лука сорта Спартан Баннер, когда они хранились при 20 ° C в течение 8 месяцев. Активность постепенно увеличивалась с четвертого месяца в магазине (Hanum et al. , 1995). Измерение сульфоксида γ-глутамилпропенилцистеина и PeCSO в луковицах семи сортов лука при хранении в прохладном месте в течение 4 месяцев показало постепенное снижение уровней сульфоксида γ-глутамилпропенилцистеина и повышение уровней PeCSO (Kopsell et al. , 1999).Исследование луковиц показало, что некоторые из них оставались бездействующими во время хранения, в то время как другие сорта выходили из состояния покоя после первого месяца. Очевидно, что сорта лука различаются по характеристикам хранения, и это может объяснить разные результаты по активности γ-глутамилтранспептидазы, обнаруженные в этих исследованиях.

В прорастающих луковицах лука это связано с гидролизом и ремобилизацией γGP. Γ-глутамилтранспептидаза была частично очищена из лука (Lancaster and Shaw, 1994), который проявлял как пептидазную активность, которая не зависела от pH, так и активность транспептидазы, которая существенно повышалась при pH выше 8.0. Он показал значения K _m между 0,4 мМ и 2,0 мМ для нескольких производных γ-глутамила и значение K _m для глутатиона 5 мМ. Его субстраты включали γ-глутамилметилцистеин, γ-глутамилпропенилцистеин, 2-карбоксиглутатион и сульфоксид γ-глутамилпропенилцистеина, причем для последних двух значений K _m были ниже расчетных клеточных концентраций (Lancaster and Shaw , 1994). Если гидролиз γ-глутамиловой части сульфоксидов γ-глутамилалк (ен) илцистеина требовался во время синтеза CSO в этих тканях, этот фермент мог быть задействован, и эксперименты in vitro показали, что он обладает широкой субстратной специфичностью.Имеются также данные о другом пути деградации глутатиона у некоторых растений (рис. 3B), который начинается с удаления остатка глицина из глутатиона, а не глутамильной группы (Leustek et al. , 2000).

Контроль биосинтеза предшественников ароматизаторов: влияние подачи и хранения серы и азота

Очевидно, что для биосинтеза ароматических соединений требуется значительное количество серы. При коммерческом производстве лука обычно считается, что на остроту влияет сера, при этом более высокая доступность серы, как правило, приводит к большей интенсивности вкуса.Существует коммерческий интерес к выращиванию мягкого лука, и это обычно предполагает использование соответствующих сортов лука в среде с низким содержанием серы (Randle et al. , 1995). Исследования влияния этих режимов роста на вкус дают некоторую информацию о биосинтезе аромата. Влияние на накопление серы и уровни ароматических соединений в луке при изменении среды роста предполагает, что MCSO ведет себя иначе, чем PeCSO.

Хотя PeCSO является основным CSO в луке, синтез MCSO можно улучшить, изменив условия выращивания за пределами диапазонов, обычно встречающихся в сельском хозяйстве.К ним относятся низкий уровень серы (S) и высокий уровень азота (N). Исследование 16 сортов лука короткого дня, выращенных в искусственной почвенной среде с двумя уровнями содержания серы (в виде сульфата, 2,0 мМ и 0,05 мМ), показало, что, хотя луковицы, выращенные с более высоким уровнем серы, содержали больше предшественников аромата (Randle and Bussard, 1993), было мало корреляции между уровнями серы в почве и предшественниками ароматизаторов (измеренными как ферментативно генерируемый пируват). Однако более позднее исследование только трех сортов лука (Рио-Гранде, Саванна Свит и Саутпорт Уайт Глоб) дало более подробную картину.Эти луковицы выращивали на песке, поддерживающем пять уровней сульфата (Randle et al. , 1995). При самом низком уровне сульфата (0,05 мМ) все сорта демонстрировали симптомы дефицита серы, но почти 95% общей серы в луковице можно было отнести к MCSO, PCSO и PeCSO и сульфоксиду γ-глутамилпропенилцистеина, что указывает на биосинтез предшественника вкуса. был сильным поглотителем серы даже при недостатке серы. При наивысшем уровне использованного сульфата (1,55 мМ) менее 40% серы в луковице могло быть отнесено к этим соединениям и, вместо этого, должно было присутствовать в компонентах пути биосинтеза ароматизатора, которые не были измерены, или в других органических соединениях серы. .

В более позднем исследовании было обнаружено значительное количество сульфата в луковицах этих трех сортов, которое увеличивалось по мере увеличения уровня сульфата в искусственной питательной среде (Randle et al. , 1999). Общее количество серы в луковицах всех трех сортов было одинаковым на каждом уровне сульфата в среде и увеличивалось по мере увеличения уровней. Уровень CSO (измеренный как ферментативно генерируемый пируват) также увеличивался в ответ на увеличение содержания сульфата в среде для выращивания, но уровни отдельных CSO были разными для трех сортов.MCSO преобладала при самых низких уровнях сульфата во всех трех сортах и ​​оставалась аналогичной или уменьшалась по мере увеличения содержания сульфата в среде. Выше 0,425 мМ уровень PeCSO повышался до уровня MCSO или превышал его. Саутпорт Уайт Глоуб имел более низкий уровень PeCSO, чем два других сорта, на который не повлияло увеличение содержания сульфата. Уровни PeCSO в Рио-Гранде были выше, но также не подвержены влиянию сульфатов в окружающей среде. Однако уровни в Savannah Sweet неуклонно снижались по мере увеличения содержания сульфата.McCallum et al. (2002) наблюдали изменения в уровнях транскриптов нескольких генов, необходимых для поглощения и ассимиляции сульфатов (APS-редуктаза, АТФ-сульфурилаза, высокоаффинный переносчик сульфата и сульфитредуктаза) в ответ на временное или долгосрочное лишение серы сортов лука Canterbury Longkeeper и Houston Grano, указывающие на то, что регулирование этих начальных стадий ассимиляции серы также лежит в основе различий во вкусе лука.

Для выращивания перезимованного лука с мягким вкусом на супесчаной почве в регионе Видалия, США, применение удобрений, содержащих S , не рекомендуется с весны, так что лук будет испытывать среду с пониженным содержанием серы. .Сульфат применяется зимой, чтобы обеспечить хороший рост корней и листьев. При исследовании графика вывода сульфата сорт Sweet Vidalia выращивали в искусственной среде, где начальный уровень 1 мМ сульфата был снижен до 0,05 мМ для шести групп растений с последовательными двухнедельными интервалами (Randle et al. ). , 2002). Анализ содержания серы в листьях и луковицах при сборе урожая показал, что было больше серы в луковицах или листьях, где более высокий уровень серы сохранялся до ближайшего времени сбора урожая.Уровни CSO (измеренные как ферментативно генерируемый пируват) также были выше в луковицах, выдерживаемых при концентрации 1 мМ сульфата дольше. Однако анализ отдельных CSO и сульфоксида γ-глутамилпропенилцистеина показал, что, хотя низкие уровни PCSO не зависели от снижения содержания сульфата, уровни γ-глутамилпропенилцистеинсульфоксида и PeCSO увеличивались в луковицах растений, поддерживаемых на более высоком уровне. сульфата дольше. Уровни MCSO были постоянно самыми высокими, но снижались, когда вывод сульфата откладывался.Различное поведение трех предшественников аромата было очень очевидным.

Метаболизм серы тесно связан с метаболизмом азота через выработку аминокислоты цистеина как первого органического соединения серы при ассимиляции серы. Таким образом, подача азота может влиять на поглощение серы и образование CSO. Интересно, что N, по-видимому, не влияет на уровень неорганической S (измеряемой в виде сульфата) в луковицах, а вместо этого изменяет уровни некоторых ассимилятов серы.Когда сорт лука Granex 33 был выращен гидропонно с 250 мг на литр ^-1 S и 20-140 мг на литр ^-1 N (из нитрата аммония), хотя уровень неорганической серы в луковицах не был затронут, органическая сера в луковицах оставалась неизменной. луковиц увеличивалось, когда количество серы в гидропонной среде увеличивалось примерно до 80 мг / л ^-1 N, но впоследствии уменьшалось (Coolong and Randle, 2003 a ). Анализ CSO и γGP показал, что основной эффект был на сульфоксид γ-глутамилпропенилцистеина, где уровни увеличивались примерно в 10 раз до 80 мг / л ^-1 N, а затем существенно снижались.Уровни PCSO практически не пострадали, но MCSO постоянно увеличивалась по мере увеличения внешнего уровня азота. PeCSO также находился под влиянием, немного увеличиваясь, когда уровень азота в гидропонной среде повышался до 80 мг / л ^-1 N, но затем немного снижался. Как следствие, PeCSO вносил основную долю предшественников ароматизатора при более низких уровнях азота (20–56 мг на л ^-1 N), а MCSO был основным компонентом выше 80 мг на литр ^-1 Н. Разница в поведении между Интересны три предшественника аромата, так же как и тот факт, что действительно основное влияние было на уровни γGP, а не CSO.

В дополнение к этому исследованию уровень серы и азота, доступный для сорта Granex 33 по мере его созревания в гидропонной культуре, варьировался (5, 45 и 125 мг л ^-1 S в виде сульфата; 10, 50, 90 и 130 мг / л ^-1 N нитрата аммония). Самый низкий уровень азота привел к появлению симптомов дефицита, включая пожелтение листьев и небольших луковиц, содержащих меньшее количество N, S, CSO и γGP, чем после всех других обработок (Coolong and Randle, 2003 b ).При самом низком уровне N (10 мг / л ^-1 ) уровни MCSO, PCSO и γGP в луковицах оставались низкими и неизменными, независимо от поступления серы. Единственным исключением были уровни PeCSO. Это было выше в среде с дефицитом азота при самом низком уровне серы, чем при более адекватной подаче азота. Уровни MCSO были постоянно выше, чем у PeCSO. Это указывает на то, что поступление азота, а не серы, оказывает большее влияние на уровни MCSO. Различные эффекты поставки S на PeCSO и γGP предполагают, что их синтез находится под разным контролем.

Еще одно исследование, которое показало различное поведение MCSO и PeCSO, проводилось во время хранения луковиц лука более 4 месяцев. За это время уровни PeCSO увеличились во всех шести сортах лука, в то время как уровни MCSO остались практически такими же или снизились (Kopsell et al. , 1999).

Тканевое и субклеточное расположение

Имеется ограниченная информация о том, где синтезируются предшественники ароматизаторов, и это обобщено для местоположений внутри ячейки на рис.4. После выделения хлоропластов, митохондрий и цитоплазмы из эпидермиса листьев прорастающих луковиц лука глутатион был идентифицирован в хлоропластах и ​​цитоплазме, в то время как CSO и γGP располагались только в цитоплазме, а γ-глутамилцистеин — в хлоропластах ( Lancaster и др. , 1989). Также было идентифицировано расположение нескольких активностей ферментов, необходимых для биосинтеза. Один из ферментов, необходимых для биосинтеза глутатиона, γ-глутамилцистеинсинтетаза, находится в хлоропластах, тогда как γ-глутамилтранспептидаза находится в цитоплазме, хотя небольшая часть может быть связана с пероксисомами.

Рис. 4.

Субклеточное расположение промежуточных продуктов биосинтеза, предшественников ароматизаторов и аллииназы в Allium s. Местонахождение основано на данных по луку и чесноку, а также на местонахождении подобных ферментов в других растениях. У лука аллииназа присутствует в вакуоли всех клеток. В чесноке аллииназа присутствует только в вакуоли клеток оболочки пучка. Не в масштабе.

Рис. 4.

Субклеточное расположение промежуточных продуктов биосинтеза, предшественников ароматизаторов и аллииназы в Allium s.Местонахождение основано на данных по луку и чесноку, а также на местонахождении подобных ферментов в других растениях. У лука аллииназа присутствует в вакуоли всех клеток. В чесноке аллииназа присутствует только в вакуоли клеток оболочки пучка. Не в масштабе.

Зрелые клетки луковицы луковицы большие и тонкостенные с тонким периферическим слоем цитоплазмы, выстилающей внутреннюю часть стенки. Большая центральная вакуоль занимает большую часть объема клетки. Электронная микроскопия показала наличие мелких пузырьков как в цитоплазме, так и в центральной вакуоли (Turnbull et al., 1981). Выделение вакуолей из чешуек внутренней луковицы показало, что литический фермент аллииназа изолирован внутри вакуоли, в то время как предшественники аромата находятся в цитоплазме (Lancaster and Collin, 1981). Дальнейшее исследование (Lancaster et al. , 1989) субклеточной локализации в луке подтвердило эти результаты. Прорастающие листья лука инкубировали с ³⁵ S-сульфатом в течение 1 дня для мечения предшественников ароматизатора. CSO были обнаружены в цитоплазматической фракции.Свидетельством того, что аллииназа была изолирована в вакуоли, был сильный запах лука, который обнаруживался при лизировании протопластов и вакуолей.

В отличие от лука, аллииназа в чесноке ограничена определенными типами клеток. Запасной орган лука состоит из чешуек, образовавшихся от набухших оснований листьев, тогда как у чеснока он образован от набухших боковых почек. Зубчики чеснока содержат сильно вакуолизированные клетки паренхимы как запасной мезофилл, перемежающийся с сосудистыми пучками. Когда свежие срезы гвоздики рассматривали в синем свете (Ellmore and Feldberg, 1994), наблюдалась сильная желто-зеленая автофлуоресценция от клеток оболочки пучка, а не от клеток любого другого типа.Эти клетки образовывали слой толщиной от одной до четырех клеток вокруг сосудистых пучков. Флуоресценцию приписывают кофактору пиридоксаль-5′-фосфата, присутствующему в аллииназе. Это было подтверждено окрашиванием срезов зубчиков чеснока на активность аллииназы, где клетки оболочки пучка стали плотно окрашены, с указанием того, что пятно было в вакуоли (Ellmore and Feldberg, 1994). Поликлональные антитела к аллииназе также интенсивно окрашивали внутреннюю часть клеток оболочки пучка. Окрашивание соседнего запасающего мезофилла, хотя и присутствовало, было намного слабее, и не было окрашивания клеток мезофилла, более удаленных от сосудистых пучков.Это клеточно-специфическое расположение аллииназы в чесноке отличается от ситуации в луке, где данные свидетельствуют о том, что она присутствует в вакуолях всех клеток луковиц и листьев.

Луковицы лука луковицы появляются в течение 4–6 недель, когда растение увеличивается в весе в 3–4 раза. Ланкастер и его коллеги проследили изменения в предшественниках вкусовых добавок, которые произошли во время этого процесса (Lancaster et al. , 1986). Белые нефотосинтетические основания листьев набухают, образуя луковицу в виде ряда концентрических чешуек.Новые чешуйки луковицы быстро расширяются в центре развивающейся луковицы, тогда как более старые стареют так же быстро, образуя внешние бумажные защитные слои. Анализ предшественников аромата в листьях и чешуях луковиц развивающихся луковиц показал, что предшественники аромата перемещались от листовой пластинки к ее основанию по мере развития чешуек луковицы (Lancaster et al. , 1986). Листовые пластинки содержали большое количество всех трех предшественников аромата до образования луковиц, но по мере развития луковиц уровни упали на 90%, и только PCSO оставалось в значительных количествах.По мере созревания луковицы предшественники аромата были потеряны из внешних стареющих чешуек, и PCSO увеличилось в центральных чешуях, хотя уровни MCSO и PeCSO упали. Самые внутренние чешуйки луковицы не имели прикрепленных листовых пластинок, но содержали предшественники аромата. Анализ базальной пластинки луковицы обнаружил значительное количество предшественников аромата, что указывает на то, что это может быть путь движения между чешуей. При исследовании трех различных сортов лука (Hysam, Durco и Grano de Oro) Bacon et al. (1999) определила, что PeCSO был основным предшественником ароматизатора, и его уровень повышался во внутренних мясистых слоях, а также в верхней и нижней части луковиц после 6 месяцев хранения при 0–0,5 ° C. Уровни предшественников аромата были выше во внутренних мясистых слоях луковиц, а также в верхнем и нижнем сантиметрах луковиц, чем в двух внешних мясистых слоях луковиц.

Ферменты, которые могут участвовать в биосинтезе предшественника ароматизатора

Вторичные метаболические пути могут осуществляться через более чем один компартмент или тип клеток.Это может быть необходимо для регуляции или функции метаболита, но также может быть результатом эволюционного происхождения ферментов (Pichersky and Gang, 2000). Новый фермент возникнет как разновидность существующего фермента, который использовал аналогичный субстрат и катализировал образование аналогичного продукта. Некоторые из ферментов, которые были предложены для катализирования стадий биосинтеза ароматических соединений в Allium s, являются членами больших семейств, которые выполняют очень разнообразные функции. При вторичном метаболизме единственный способ однозначно определить функцию продукта гена в настоящее время — продемонстрировать его ферментативную активность.Было проведено очень мало исследований ферментов из Allium s, которые были бы необходимы для синтеза предшественников ароматизаторов. Следовательно, будет представлена ​​информация о метаболизме глутатиона и цистеина и C-S-лиазах с указанием аспектов, которые могут иметь отношение к ролям в биосинтезе предшественника ароматизатора Allium .

Глутатион и глутатион-

Прекурсоры аромата Allium s — одно из немногих мест, где конъюгаты глутатиона, как полагают, играют роль в эндогенном метаболизме растений.Обе стадии, предложенные для конъюгации глутатиона с метильными, 2-карбоксипропильными или метакрилатными группами, и последующая деградация глутатионовой части с образованием CSO имеют параллели в метаболизме глутатиона, который изучался на других растениях. Глутатион синтезируется как в цитозоле, так и в хлоропласте, и это согласуется с доступностью цистеина (Noctor et al. , 2002). Он не продуцируется с одинаковой скоростью всеми тканями и типами клеток растений. Например, трихомы на стеблях и листьях некоторых экотипов Arabidopsis thaliana демонстрируют гораздо более высокую экспрессию ферментов, участвующих в синтезе цистеина и глутатиона, и имеют более высокие уровни глутатиона, чем окружающие клетки (Gutierrez-Alcala et al., 2000). Если для синтеза CSO требуется глутатион, контроль синтеза глутатиона в Allium s вполне может отражать потребность в гораздо более высоком потоке, чем в других растениях.

Глутатион- S -трансферазная активность в Allium s детально не изучена. Он был обнаружен в эпидермальной ткани луковиц лука. Он присутствовал как в цитозольной, так и в микросомальной фракциях, и анализы с серией субстратов показали, что ферменты в каждом компартменте имели различную специфичность (Schröder and Stampfl, 1999).Когда конъюгация с флуоресцентным субстратом монохлорбиманом наблюдалась под микроскопом в эпидермальных полосках, флуоресценция была очевидна в цитоплазме и ядре, за которой следовала яркая и увеличивающаяся флуоресценция в вакуоли, когда конъюгат транспортировался туда.

Глутатион- S -трансферазы представляют собой большое и древнее суперсемейство ферментов, где N-концевой сайт связывания глутатиона лучше консервативен, чем C-концевой сайт связывания совместного субстрата. Экспрессия специфических глутатион- S -трансфераз заметно варьирует во время развития растений, деления клеток и старения (Marrs, 1996).Роль глутатион- S -трансфераз в детоксикации ксенобиотиков, таких как гербициды, широко изучалась (обзор Marrs, 1996; Coleman et al. , 1997). Они действуют совместно с другими ферментами, выводя токсины из ксенобиотиков за счет конъюгации с глутатионом для повышения растворимости в воде. Это опосредуется глутатион- S -трансферазами в цитозоле, и затем конъюгат транспортируется в вакуоль или апопласт с помощью транспортеров, расположенных внутри тонопласта или плазматической мембраны.Вакуолярная карбоксипептидаза может отщеплять глицин от конъюгатов глутатион- S , а дипептидаза может удалять глутамильную группу, оставляя цистеиновый конъюгат (цитируется в Coleman et al. , 1997). Отток конъюгатов цистеина из вакуоли сопровождается дальнейшим метаболизмом C-S-лиазами в цитозоле. Метаболиты, продуцируемые этим процессом, могут экспортироваться в апопласт и связываться с лигнином и целлюлозой (Coleman et al. , 1997).

Биосинтез предшественников ароматизатора Allium может быть примером использования этой системы для синтеза вторичных метаболитов, хотя, по-видимому, задействованы разные клеточные компартменты.Как показано на рис. 4, аллииназа изолирована в вакуоли, а не в цитоплазме, а CSO находятся в цитоплазме (Lancaster and Collin, 1981) или в небольших цитоплазматических пузырьках (Edwards et al. , 1994). Хотя сульфоксиды γ-глутамилалк (ен) илцистеина не являются субстратами для аллииназы, если они обрабатываются в вакуоли, им может потребоваться защита от аллииназы перед экспортом в цитоплазму. В этом контексте наблюдение, что аллииназа образует стабильный комплекс с лектином в чесноке (Rabinkov et al., 1995; Смец и др. , 1997). Эти два являются основными белками зубчиков чеснока, и хотя нет никаких доказательств того, что этот комплекс существует in vivo , он может обеспечить средства для дальнейшего отделения аллииназы от ее субстрата.

Синтез цистеина

Требование высоких уровней продукции цистеина в Allium s предполагает, что регуляция биосинтеза цистеина может отличаться от других растений.Кроме того, исследования включения серина и тиолов в Allium s (Granroth, 1970; Ohsumi et al. , 1993; Prince et al. , 1997) показывают, что биосинтез цистеина может обеспечить путь для синтеза некоторых S -алк (ен) ил цистеинов.

Заключительная стадия синтеза цистеина катализируется двумя последовательными ферментами, серинацетилтрансферазой (SAT (EC 2.3.1.30) и цистеинсинтазой (Leustek et al. , 2000). Это стадия, на которой неорганическая сера включается в первое органическое соединение серы в клетке, а также точка, в которой пути ассимиляции углерода и азота встречаются с ассимиляцией серы.После добавления O -ацетильной группы к серину с помощью SAT образуется аминоакрилатный аддукт O -ацетилсерина, связанный с пиридоксаль-5′-фосфатным кофактором CS. Он реагирует со вторым субстратом, сульфидом, с образованием цистеина, который высвобождается (Warrilow and Hawkesford, 2002). Каталитический механизм CS с промежуточным соединением, связанным с ферментом, обеспечивает возможности для развития активного центра для размещения различных заместителей.

Растения содержат семейства SAT и CS с цитозольными, хлоропластическими и митохондриальными изоформами (Inoue et al., 1999). Причина множественных форм и их наличие в отдельных органеллах неясна. С точки зрения синтеза предшественников ароматизатора Allium наиболее интересным аспектом является то, что некоторые CS обладают более широкой субстратной специфичностью, чем один сульфид. Фермент принадлежит к семейству β-замещенных аланинсинтаз, и существует несколько примеров активности CS с вторичной, а не первичной метаболической ролью (Ikegami and Murakoshi, 1994). Вид Mimosa L.и Leucaena Benth. накапливают мимозин, а представители семейства тыквенных, такие как арбуз ( Citrullus vulgaris Schrad.), содержат β-пиразол-1-илаланин. Оба этих вторичных метаболита образуются CS путем связывания пиразола или 3,4-дигидроксипиридина с O -ацетилсерином. Другие гетероциклические β-замещенные аланины были идентифицированы в составе других видов растений, помимо метаболитов регуляторов роста зеатина и 6-бензиламинопурина, а также ксенобиотиков, таких как триазольные гербициды (Ikegami and Murakoshi, 1994), которые все могут быть синтезированы путем конденсации соответствующее N -гетероциклическое соединение с O -ацетилсерином, опосредованное CS из видов растений, где вторичный метаболит встречается в природе.

В условиях анализа in vitro CS может использовать множество других соединений в качестве акцептора для аланильной части из O -ацетилсерина. Когда представлены подходящие субстраты, CS, очищенные от Leucaena leucocephala Lam. (De Wit), Pisum sativum L., Citrullus vulgaris , Spinacia oleracea , Lathyrus latifolius L., Lathyrus sativus L. и Allium tuberosum Rottl. ex Spreng.все были способны синтезировать S -метилцистеин, S -аллилцистеин и S -карбоксиметилцистеин со скоростью от 1% до 72% от таковой для синтеза цистеина (Ikegami and Murakoshi, 1994). С другими субстратами ферменты CS этих видов образовывали другие небелковые β-замещенные вторичные метаболиты аланина in vitro (Ikegami and Murakoshi, 1994).

SAT и CS из A. tuberosum были подробно изучены (Ikegami et al., 1993; Урано и др. , 2000). Два CS были очищены из листьев, которые не показали ингибирования O -ацетилсерином в концентрациях до 25 мМ. Оба они были способны синтезировать S -замещенные цистеины, а также β-цианоаланин, хотя и со скоростью менее 10% от цистеина в тех же условиях (Ikegami et al. , 1993). Субстраты, используемые этими ферментами, очень похожи на субстраты, используемые ферментом Spinacia oleracea .Измерение чувствительности SAT A. tuberosum к цистеину показало, что концентрация для 50% ингибирования составляла 48,7 мкМ, что было промежуточным между значениями, обычно получаемыми для чувствительных к обратной связи (<5 мкМ) и нечувствительных (> 100 мкМ) ферментов (Urano и др. , 2000). Уровни цистеина в A. tuberosum , около 45 нмоль на г ^-1 сырого веса, были оценены в 5–6 раз выше, чем в Nicotiana tabacum L. или Arabidopsis thaliana .Интересно, что уровни окисленного и восстановленного глутатиона у трех растений были сопоставимы. Более высокий уровень цистеина в A. tuberosum можно объяснить низкой чувствительностью SAT к ингибированию цистеина или другими факторами в обороте цистеина, необходимыми для удовлетворения спроса на биосинтез предшественника ароматизатора. Работа в нашей лаборатории показала, что чеснок имеет несколько CS, которые различаются по экспрессии в тканях и способности синтезировать S -аллил цистеин (A Tregova, J Hughes and J Milne, неопубликованная работа).

Продукция O -ацетилсерина с помощью SAT из Citrullus vulgaris (арбуз) проявляет ингибирование цистеином на физиологических уровнях (50% ингибирование при 2,9 мкМ), но не подвергается влиянию вторичного метаболита β-пиразол-1- илаланин даже в концентрации 1 мМ (Saito et al. , 1995), что позволяет предположить, что фермент ведет себя по-разному в регулировании поставки O -ацетилсерина для выполнения своих первичных и вторичных метаболических ролей. Синтез цистеина можно жестко регулировать, тогда как синтез β-пиразол-1-илаланина на этой стадии не контролируется.Если CS участвует в биосинтезе предшественников ароматизатора Allium , возможно, что подобная регуляторная система может быть задействована.

Последний пример цистеина в синтезе соединений, аналогичных предшественникам ароматизатора Allium , происходит из механизма толерантности к селену, обнаруженного у некоторых растений. Сера и селен химически подобны, и, таким образом, селен может быть включен в соединения, которые должны содержать серу, что приводит к проблемам токсичности.Анализ селенсодержащих летучих веществ из лука, чеснока, A. tuberosum и A. ampeloprasum L. показал, что Se-метильные соединения преобладают, несмотря на обилие других соединений S -алк (ен) ила в растения (Cai et al. , 1994). В некоторых ситуациях происходит различие между этими двумя элементами, и один из них заключается в синтезе Se-метил селеноцистеина в механизме толерантности растений Fabaceae, которые накапливают высокие уровни селена (Ellis and Salt, 2003).Растения синтезируют Se-метил селеноцистеин, γ-глутамил-Se-метил селеноцистеин и другие производные селена небелковых аминокислот, которые можно рассматривать как селеновые аналоги S -алк (ен) илцистеина и γ-глутамил- алк (ен) ил цистеиновые пептиды. Идентификация тиол / селенолметилтрансферазы из Astragalus bisulcatus (Neuhierl et al. , 1999) прояснила биосинтез этих метаболитов. Экспрессия фермента в Escherichia coli показала, что его субстратами были S -метилметионин и селеноцистеин, а активность с цистеином была близка к пределам обнаружения анализа.Хотя этот фермент из A. bisulcatus не может синтезировать S -метилцистеин, синтез этих метилированных и γ-глутамилированных аминокислот представляет собой интересную параллель с биосинтезом предшественника ароматизатора в Allium s.

Аллииназа и лиазы C-S

C-S-лиазы в растениях участвуют в первичном и вторичном метаболизме, расщепляя связи между атомами серы и углерода, и являются частью более крупного семейства аминотрансфераз.Члены включают аллииназу, а также цистатионин и цистинлиазы, цистеин-десульфидразу и ферменты, участвующие в детоксикации ксенобиотиков после конъюгации с глутатионом, а также, вероятно, другие, участвующие в биосинтезе глюкозинолатов и цианогенных глюкозидов (Kiddle et al. , 1999). Есть признаки того, что луковая аллииназа предпочтительно гидролизует PeCSO, а не MCSO или PCSO, поэтому PeCSO вносит больший вклад в аромат лука, чем два других предшественника (Nock and Mazelis, 1987; Coolong and Randle, 2003 b ).

Трехмерная кристаллическая структура аллииназы была решена с разрешением 1,5 Å в 2002 г. (Kuettner et al. , 2002). Это показало, что каждый 448 аминокислотный мономер фермента содержит три домена. Центральный и С-концевой домены имеют складчатую структуру, типичную для других C-S лиаз и аминотрансфераз. Центральный домен типичен для пиридоксаль-5′-фосфатзависимых ферментов класса 1. N-концевой домен отличает структуру аллииназы от других C-S лиаз и аминотрансфераз благодаря наличию EGF-подобного домена.Этот тип домена часто взаимодействует с другими белками и обычно содержит три дисульфидных мостика, образованных между остатками цистеина. Они редко встречаются в растительных белках, и аллииназа является первой, где EGF-подобный домен сливается с каталитическим доменом, а не как внеклеточная часть мембраносвязанного или секретируемого белка. Однако вакуолярное расположение аллииназы требует процесса транспорта после синтеза, который может обеспечивать функцию этого домена.

Источники алк (ен) ильных групп в прекурсорах ароматизатора

Хотя очевидно, что ряд тиолов может быть источником S -алк (en) ильных групп для ферментов CS in vitro (Ikegami and Murakoshi, 1994), в срезах ткани или в тканевой культуре (Granroth, 1970; Prince et al., 1997), неизвестно, играют ли они эту роль in vivo. Растительные ацил-активирующие ферменты особенно плохо охарактеризованы (Shockey et al. , 2003), и даже некоторые из этих параллельно хорошо охарактеризованных ферментов млекопитающих, по-видимому, играют разные роли. Arabidopsis thaliana , по-видимому, имеет 63 организма, что больше, чем у любого другого полностью секвенированного организма на сегодняшний день, предлагая большие возможности для опосредования стадий вторичного метаболизма, с возможностью того, что некоторые или их гомологи в Allium s могут выполнять неуловимый перенос алк (ен) ила в биосинтезе предшественника ароматизатора Allium (Shockey et al., 2003). Селеноцистеинметилтрансфераза из Astragalus bisulcatus , которая использует S -метилметионин для метилирования селеноцистеина, а не цистеина (Neuhierl et al. , 1999), является одним из примеров специализированной активности.

Метакрилат, предложенный в качестве предшественника аллильной, пропильной и пропенильной групп (Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989), встречается внутри клетки во время распада валина жирной кислоты с разветвленной цепью, вероятно, внутри пероксисомы растения.Реакционноспособный интермедиат метакрилил-КоА временно образуется во время этого процесса и может реагировать с нуклеофилами, такими как свободные тиолы (Zolman et al. , 2001). Хотя было выявлено заболевание человека, вызванное накоплением этого реактивного промежуточного продукта в митохондрии, у Arabidopsis thaliana тот же самый дефект вызывает устойчивость к ауксину и дефекты β-окисления в пероксисоме. Результат может быть другим в пероксисомах, где метакрилил-КоА синтезируется в регулируемом процессе с обильным поступлением тиолов из цистеина или глутатиона.

Еще один пример возможного происхождения аллильной группы, характерной для чеснока, — это более 120 вторичных метаболитов глюкозинолатов, обнаруженных в Brassicaceae, Capparaceae и Caricaceae (Fahey et al. , 2001). Биосинтез основной структуры глюкозинолата включает конъюгацию модифицированной аминокислоты с донором серы, предположительно цистеином, с последующим расщеплением, вероятно, CS-лиазой, с получением серосодержащего продукта, который впоследствии глюкозилируется и сульфатируется (Wittstock and Halkier , 2002).Может происходить очень обширная модификация аминокислоты, включая создание аллильной группы. Между окислением модифицированной аминокислоты цитохромом P ₄₅₀ с образованием альдоксима и образованием тиогидроксимовой кислоты перед гликозилированием не было идентифицировано ни промежуточных продуктов, ни ферментов. Хотя активность C-S-лиазы, полученная из листьев Brassica napus , была способна расщеплять потенциальные промежуточные продукты биосинтеза, также использовались другие неприродные субстраты, что позволяет предположить присутствие нескольких ферментов (Kiddle et al., 1999). Замена сульфгидрильной группы цистеина и расщепление C-S-лиазой имеет очевидные параллели с ароматической системой Allium , которую можно было бы исследовать.

Заключительные замечания

Таким образом, понимание биосинтеза ароматизаторов в Allium s является захватывающим моментом. Биосинтетический путь, предложенный Ланкастером и его коллегами, обеспечил жизненно важную основу для интеграции результатов исследований на срезах тканей, культуре тканей и интактных растениях, хотя взаимосвязь между CSO и γGP до сих пор полностью не решена.Исследования эффектов серного питания дополнили современные знания о поведении каждого предшественника вкуса. Накапливается информация, позволяющая предположить, что биосинтез MCSO и, возможно, каждого предшественника аромата может регулироваться по-разному и может не идти одним и тем же путем во всех физиологических условиях. Пониманию этой интригующей области вторичного метаболизма будет способствовать растущее знание метаболизма глутатиона и цистеина в других растениях, в частности Arabidopsis thaliana , что дает параллели для исследования.Следующим этапом будет идентификация и изучение большего количества ферментов и генов в Allium s, которые участвуют в биосинтезе предшественников вкуса. Цистеинсинтазы являются очевидными мишенями, как и ферменты метаболизма глутатиона. Неуловимые источники характерных алк (ен) ильных групп Allium остаются неизвестными, и их идентификация является одновременно проблемой и целью.

Мы благодарны за обсуждение с коллегами и финансовую поддержку проекта ЕС «Чеснок и здоровье», QLK1-CT-1999-00498.

Список литературы

Анкри С., Мирельман Д.

1999

Микробы и инфекции

1

125

Bacon JR, Moates GK, Ng A, Rhodes MJC, Smith AC, Waldron KW.

1999

Пищевая химия

64

257

Блок E.

1992

Angewandte Chemie

31

1135

Brodnitz MH, Pascale СП.

1971

Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии

19

269

Cai XJ, Uden PC, Block E, Zhang X, Quimby BD, Sullivan JJ.

1994

Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии

42

2081

Ceci LN, Curzio OA, Pomilio AB.

1992

Фитохимия

31

441

Коулман Джод, Блейк-Калфф ММА, Дэвис ТГЭ.

1997

Тенденции в растениеводстве

2

144

Коли-Смит младший.

1986

Патология растений

35

362

Collin HA.

2001

Положение о выращивании растений

34

119

Coolong TW, Randle WM.

2003

Журнал продовольственной науки и сельского хозяйства

83

477

Coolong TW, Randle WM.

2003

Журнал Американского общества садоводческих наук

128

776

Дэви М.Р., Маккензи И.А., Фриман Г.Г., Шорт К.С.

1974

Письма о растениеводстве

3

113

Эрншоу DM, McDonald MR, Boland GJ.

2000

Канадский журнал патологии растений

22

387

Эдвардс SJ, Бриттон G, Collin HA.

1994

Ткани и культура клеток растений

38

181

Ellis DR, Salt DE.

2003

Текущее мнение по биологии растений

6

273

Ellmore GS, Feldberg RS.

1994

Американский журнал ботаники

81

89

Fahey JW, Zalcmann AT, Talalay P.

2001

Фитохимия

56

5

Фенвик Дж., Хэнли А.

1985

Критические обзоры пищевой науки и питания

22

199

Gmelin R, Huxa H-H, Roth K, Höfle G.

1976

Фитохимия

15

1717

Гранрот Б.

1970

Annales Academiae Scientiarum Fennicae

154

1

Gutierrez-Alcala G, Gotor C, Meyer AJ, Fricker M, Vega JM, Romero LC.

2000

Proceedings of the National Academy of Sciences, USA

97

11108

Hanum T, Sinha NK, Cash JN.

1995

Журнал пищевой биохимии

19

51

Икегами Ф, Итагаки С., Муракоши И.

1993

Фитохимия

32

31

Икегами Ф, Муракоши И.

1994

Фитохимия

35

1089

Имаи С., Цуге Н., Томотаке М., Нагатом Й., Савада Х., Нагата Т., Кумагаи Х.

2002

Природа

419

685

Иноуэ К., Нодзи М., Сайто К.

1999

Европейский журнал биохимии

266

220

Киддл Джорджия, Беннетт Р.Н., Хик А.Дж., Уоллсгроув, РМ.

1999

Завод, клетки и окружающая среда

22

433

Кинг Дж. Дж., Брейдин Дж. М., Барк О., Маккаллум Дж. А., Хавей М. Дж..

1998

Теоретическая и прикладная генетика

96

52

Kopsell DE, Randle WM, Eiteman MA.

1999

Журнал Американского общества садоводческих наук

124

1777

Кубек Р., Ким С., МакКеон Д.М., Муса Р.А.

2002

Journal of Natural Products

65

960

Кубец Р., Ким С., Велишек Дж., Муса Р.А.

2002

Фитохимия

60

21

Кубец Р., Муса РА.

2001

Allium s — большой род, содержащий около 700 видов, включая экономически важные овощи и цветущие декоративные растения, а также дикие виды из Европы, Азии и Америки (Fenwick and Hanley, 1985). Их вкус и запах легко узнаваемы в овощах, таких как Allium cepa L. (лук), Allium sativum L. (чеснок), Allium porrum L. (лук-порей), Allium schoenoprasum L.(чеснок) и Allium fistulosum L. (пучковый или валлийский лук). Многие другие представители этого рода выращиваются из-за декоративной ценности своих цветов. Большинство из них растут как двухлетние, давая в конце первого вегетационного периода луковицу для подземного хранения, которая цветет в следующем. Многие дают семена, хотя чеснок обычно не дает. Все они не имеют запаха до тех пор, пока ткань не будет повреждена, после чего все они вырабатывают летучие и реактивные серосодержащие химические вещества, которые вызывают их наиболее известную характеристику.

Природа и происхождение этих ароматических соединений, особенно в луке и чесноке, изучаются с 1940-х годов. Вскоре стало очевидно, что при повреждении растительной ткани сравнительно стабильные предшественники аромата расщепляются с образованием ряда летучих соединений серы, которые претерпевают дальнейшие химические превращения в паровой фазе. Были проведены обширные исследования и обзоры этих газообразных химикатов (Whitaker, 1976; Block, 1992), и они не будут здесь подробно обсуждаться.Вместо этого этот обзор будет сосредоточен на текущих знаниях о биосинтезе предшественников ароматизаторов, сульфоксидов (+) — S -алк (ен) илцистеина (CSO) и их родственников γ-глутамилпептида (γGP). Хотя биосинтетический путь был опубликован (Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989), все еще существует значительная неопределенность в отношении нескольких стадий, взаимосвязи между CSO и γGP и того, следует ли один и тот же путь во всех тканях.

Исследования сосредоточены вокруг роли γGP в пути биосинтеза и происхождения алк (ен) ильных заместителей цистеина.Также был значительный интерес к тому, является ли синтез соединений взаимосвязанным и как он регулируется. О некоторых аспектах, таких как стадия окисления, необходимая для образования сульфоксида, известно очень мало. Имеется некоторая информация о субклеточном расположении биосинтеза аромата и о перемещении предшественников аромата и γGP во время развития растений. После перечисления предшественников аромата, которые были идентифицированы в Allium s, в этом обзоре будет кратко описаны аналогичные соединения, которые были обнаружены в других растениях, предполагая, что этот путь биосинтеза может быть одним из примеров более широко распространенного вторичного метаболического пути.За этим последует набросок доказательств использования γGP в качестве промежуточных продуктов в биосинтезе предшественника вкуса Allium и источника S -алк (ен) ильных групп предшественников. Также будут рассмотрены исследования влияния факторов окружающей среды на биосинтез предшественников аромата. Наконец, будет рассмотрена информация о биосинтезе цистеина, реакциях, в которых участвует глутатион, и источниках алкильных доноров в других растениях, поскольку это основные пути, которые имеют параллели с биосинтезом предшественника ароматизатора Allium .

Биосинтетические пути, предложенные для предшественников ароматизатора Allium , основаны главным образом на химическом анализе и исследованиях радиоактивных индикаторов. Большинство ферментативных активностей, которые потребуются для предложенных этапов биосинтеза, происходят из больших семейств белков, где in vivo тканевая, онтогенетическая и субстратная специфичность большинства членов еще предстоит установить. Применение молекулярно-генетических методов и трансформации растений позволило понять многие аспекты метаболизма растений, и в будущем эти подходы могут открыть новые возможности для улучшения знаний об этой группе вторичных метаболитов, имеющих экономическое, медицинское и кулинарное значение.

Прекурсоры ароматизатора

Четыре нелетучих CSO без запаха (таблица 1) являются предшественниками аромата и запаха Allium s. Это S -метилцистеинсульфоксид (MCSO, метиин; присутствует в большинстве Allium s, некоторые Brassicaceae), S -аллилсульфоксид цистеина (ACSO, аллиин; характерен для чеснока), S — транс — транс -проп-1-енилцистеинсульфоксид (PeCSO, изоаллиин; характерен для лука) и S -сульфоксид-пропилцистеина (PCSO, пропиин; в луке и родственных ему видах).Фермент аллииназа (EC 4.4.1.4) расщепляет эти предшественники с образованием пирувата, аммиака и тиосульфината. Последний подвергается дальнейшим реакциям, так что запах Allium s со временем меняется (Whitaker, 1976). Разложение наиболее широко распространенного из этих предшественников вкуса, MCSO, дает запахи, которые обычно описываются как «капустный» или «свежий лук», в то время как легко различимый запах чеснока происходит аналогичным образом от ACSO. Слезотечение, характерное для лука, вызвано летучим продуктом — пропантиалом S -оксидом (Brodnitz and Pascale, 1971).До недавнего времени считалось, что он образуется спонтанно из тиосульфинатных продуктов реакции аллииназы. Однако он генерируется активностью второго фермента, синтазы слезоточивого фактора, вслед за действием аллииназы на PeCSO, главный предшественник вкуса лука (Imai et al. , 2002). Четвертый предшественник ароматизатора, PCSO, также содержится в луке, а также в нескольких других Allium s. Хотя есть сообщения о появлении других сульфоксидов (+) — S -алк (en) илцистеина в составе Allium s, несколько (например,грамм. 1-оксид 5-метил-1,4-тиазан-3-карбоновой кислоты (циклоаллиин) (Whitaker, 1976), вероятно, образуется в результате химического превращения во время аналитических процедур, а не синтезируется in vivo . Другие, например (+) — S -этилцистеинсульфоксид (Kubec et al. , 2000), являются лишь незначительными составляющими или не обнаруживаются большинством рабочих. Тем не менее, есть несколько сообщений о других сульфоксидах алк (ен) илцистеина в качестве основных предшественников ароматизаторов в декоративных Allium s, таких как S -метилтиометилцистеин-4-оксид (маразмин) в Tulbaghia violacea Harv.(чеснок общества) (Kubec et al. , 2002 a ) и S -бутилсульфоксид цистеина в Allium siculum Ucria. (медовый чеснок) (Кубец и др. , 2002 b ).

Помимо CSO, несколько производных γ-глутамилпептида (γGP) этих ароматических соединений были обнаружены в пределах Allium s (Whitaker, 1976). Выделено более 17 типов (Granroth, 1970), включая γ-глутамил- S -алк (ен) илглутатионы, γ-глутамил- S -алк (ен) илцистеины и γ-глутамил- S . -алк (ен) илцистеинсульфоксиды, все из которых предположительно являются производными глутатиона (γ-глутамилцистеинилглицин).Хотя кажется, что они не вносят непосредственного вклада в аромат, в настоящее время считается, что они являются промежуточными звеньями в биосинтезе, а также могут действовать как запасы азота и серы. Их роль в пути биосинтеза будет обсуждаться ниже.

Растения производят очень большое количество низкомолекулярных соединений, традиционно называемых вторичными метаболитами, выполняющими ключевые функции, включая воспроизводство, защиту, патогенность, устойчивость к стрессу и хранение ресурсов.Биосинтетические пути большинства вторичных метаболитов не описаны подробно, и многие из них, очевидно, сложны (Wittstock and Halkier, 2002). Предположение, что 15-25% генома каждого растения посвящено вторичному метаболизму, является еще одним показателем его важности (Pichersky and Gang, 2000). Таким образом, одна из проблем при изучении вторичного метаболизма состоит в том, чтобы выяснить, какие аспекты синтеза, хранения, функции и деградации конкретного вторичного метаболита разделяют пути, параллельные первичному метаболизму и общие для разных родов, а какие уникальны. к виду или роду.

Один из самых интригующих вопросов об ароматических соединениях — их роль в Allium s. Уровни небелковых производных цистеина и глутатиона составляют 1–5% от сухого веса (Lancaster and Kelly, 1983), что указывает на то, что это основная биосинтетическая активность в растении.Две роли, которые были приписаны, заключаются в защите от вредителей и хищников, особенно в зимующей луковице, и в хранении и транспортировке углерода, азота и серы (Lancaster and Boland, 1990). Было проведено обширное исследование антимикробных свойств экстракта Allium in vitro , рассмотренного Анкри и Мирельманом (1999), но существует меньше примеров in vivo , особенно исследований, посвященных тому, как ароматические соединения передают преимущество луку . с.Устойчивость к болезням не была приоритетом при селекции современных коммерческих сортов лука, поэтому трудно оценить влияние вкусовых соединений (Б. Смит, личное сообщение). В целом, как сообщается, лук с мягким вкусом хуже хранится.

Однако несколько видов насекомых и грибов приобрели специальные взаимодействия с Allium s, где летучие ароматические вещества являются аттрактантами для специализированных питателей и патогенов. Полевые эксперименты на Sclerotium cepivorum Berk.возбудитель белой гнили, одного из наиболее экономически значимых грибковых заболеваний лука и чеснока, показал сильную зависимость от присутствия летучих ароматизаторов для прорастания склероций (Coley-Smith, 1986). Точно так же луковая моль Acrolepiopsis Assectella Zeller и луковая муха Delia antiqua Meigen привлекаются к своим соответствующим растениям-хозяевам летучими ароматическими веществами (Romeis et al. , 2003). В случае белой гнили нет действительно устойчивых сортов лука, и экспериментальное заражение может быть затруднено.Частично эта изменчивость может быть связана с луком, но также с условиями окружающей среды и грибком (Earnshaw et al. , 2000).

Одно интересное наблюдение о роли предшественников аромата было получено в эксперименте Паркина и Томаса (1996) по влиянию элиситоров на уровни предшественников аромата при дифференциации культур каллуса лука. Элиситоры, являющиеся фрагментами патогенов растений, тканями растений или сигнальными молекулами, могут запускать продукцию защитных соединений при их представлении в тканевых культурах (Collin, 2001).В их экспериментах фрагменты клеточной стенки лука и грибов, а также сигнальная молекула салициловой кислоты подавляли выработку предшественников аромата. Это противоположно тому, что можно было бы ожидать, если ароматические соединения участвуют в защите растений.

Биосинтез предшественников ароматизаторов

Исследование биосинтеза ароматических соединений Allium началось с открытия Столлом и Зеебеком (1947) того факта, что ACSO присутствует в тканях чеснока в качестве стабильного источника диаллилтиосульфината (аллицина), основного летучего ароматизатора.Они продемонстрировали, что для превращения ACSO в аллицин требуется фермент аллииназа. Еще два производных сульфоксида цистеина, MCSO и PCSO, были идентифицированы в луке Виртаненом и Матиккала (1959), а четвертый сульфоксид цистеина, PeCSO, вскоре был идентифицирован в луке (Virtanen and Spåre, 1961). Также стало очевидно, что Allium s содержат значительные количества γ-глутамилпроизводных этих соединений (обзор в Whitaker, 1976).

Ланкастер и его коллеги предложили путь (Lancaster and Shaw, 1989; Lancaster et al., 1989; Randle et al. , 1995), требуя γGP в качестве промежуточных продуктов, что стало принято в качестве биосинтетического пути (Block, 1992; Prince et al. , 1997). Путь основан, главным образом, на исследованиях радиоактивной метки и анализе тканей Allium . Он предполагает (рис. 1A), что биосинтез предшественников ароматизаторов в Allium s происходит через S -алк (эн) илилирование цистеина в глутатион с последующей транспептидацией для удаления глицильной группы, окислением до сульфоксида цистеина. и, наконец, удаление глутамильной группы с образованием CSO.Этот путь имеет параллели с деградацией глутатиона (Leustek et al. , 2000), что будет обсуждаться позже. Альтернативный путь биосинтеза (рис. 1B) исключает глутатион в пользу прямого алк (ен) илилирования цистеина или тиоалк (ен) илилирования O- ацетилсерина с последующим окислением до сульфоксида. Это также имеет параллели в производстве нескольких вторичных метаболитов, опосредованных цистеинсинтазой (CS, EC 4.2.99.8, также известной как O -ацетилсеринтиоллиаза) (Ikegami and Murakoshi, 1994).В обоих путях были подробно изучены некоторые из предложенных биосинтетических ферментов из Allium s, и их роль была выведена из других систем. Относительный вклад обоих путей во всех тканях и на протяжении всей истории жизни также неясен, и источник алк (ен) ильных групп еще предстоит выяснить.

Рис. 1.

Два предложенных пути синтеза предшественников ароматизатора Allium , показанные для синтеза сульфоксида метилцистеина.Предполагается, что биосинтез других предшественников протекает аналогично, но с участием другого донора алк (ен) ила. (адаптировано из Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989). Путь A (слева) иллюстрирует участие глутатиона, который метилируется, а затем за счет потери глицина, окисления и, наконец, потери γ-глутамильной группы, превращающейся в метилцистеинсульфоксид. Путь B показывает альтернативный путь через прямое метилирование O -ацетилсерина с образованием метилцистеинсульфоксида.

Рис. 1.

Два предложенных пути синтеза предшественников ароматизатора Allium , показанные для синтеза сульфоксида метилцистеина. Предполагается, что биосинтез других предшественников протекает аналогично, но с участием другого донора алк (ен) ила. (адаптировано из Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989). Путь A (слева) иллюстрирует участие глутатиона, который метилируется, а затем за счет потери глицина, окисления и, наконец, потери γ-глутамильной группы, превращающейся в метилцистеинсульфоксид.Путь B показывает альтернативный путь через прямое метилирование O -ацетилсерина с образованием метилцистеинсульфоксида.

Одна техническая проблема в экспериментах с использованием поврежденных тканей Allium , таких как разрезанные листья или сегменты луковиц, заключается в том, что аллииназа высвобождается и может расщеплять вновь образованные предшественники аромата. Кроме того, пептидазы и γ-глутамилтранспептидазы (EC 2.3.2.2) присутствуют в тканях лука и чеснока (Lancaster and Shaw, 1991; Ceci et al., 1992; Hanum et al. , 1995), предоставляя дополнительные возможности для обмена между биосинтетическими промежуточными продуктами предшественников ароматизаторов. Это может объяснить некоторые расхождения в результатах между разными исследовательскими группами. Некоторые исследования пытались избежать повреждения тканей, отслеживая поступление ³⁵ S-сульфата в корни проростков или прорастающих луковиц. Другая стратегия использует культуру ткани, где тонкая кутикула позволяла вводить потенциальные биосинтетические промежуточные продукты в неповрежденные, но недифференцированные клетки.

Роль γ-глутамилпептидов в биосинтезе предшественника ароматизатора

Lancaster and Shaw (1989) исследовали биосинтетические отношения между γGP и CSO, проследив судьбу короткого импульса ³⁵ S-сульфата в листьях, вырезанных из проростков лука, прорастающих зубчиков чеснока и луковиц декоративного Allium siculum. . Это исследование легло в основу предположения, что γGP являются промежуточными продуктами биосинтеза CSO.Глутатион, γ-глутамилцистеин, γ-глутамилпропенилцистеинсульфоксид, метилглутатион и S -2-карбоксипропилглутатион, наряду с несколькими неидентифицированными соединениями, были помечены в течение первых 15 минут, в то время как для радиоактивной метки потребовалось 6 часов. появляются в ОГО. Хотя на протяжении всего эксперимента в глутатионе было обнаружено некоторое количество ³⁵ S, радиоактивная метка не была обнаружена в γGP после первого дня. В листьях лука MCSO вела себя иначе, чем PeCSO и PCSO, в том смысле, что количество метки оставалось неизменным при измерениях, проведенных через 7 дней, тогда как в PeCSO количество меток увеличилось к этому времени в 8 раз, а в PCSO — в 5 раз. ³⁵ S-меченный S -2-карбоксипропилглутатион был обнаружен в луке и чесноке, но не в A. siculum .

Таким образом, импульс радиоактивной серы был включен сначала в глутатион и γGP, а затем в CSO. Появление меченного радиоактивным изотопом сульфата в глутатионе не является неожиданным, поскольку сульфат ассимилируется в цистеин, и было подсчитано, что одна треть этого количества немедленно направляется в реакции цикла глутатиона. Хотя MCSO присутствует в луке и чесноке, он был основным предшественником вкуса, обнаруженным в A.siculum Ланкастера и Шоу (1989). Присутствие меченого S -2-карбоксипропилглутатиона в луке и чесноке, но не A. siculum , позволяет предположить, что он является промежуточным звеном в биосинтезе аллильной, пропенильной и пропильной групп CSO (рис. 2), в согласии с Гранротом (1970). Аналогичное исследование (Эдвардс и др. , 1994) с использованием интактных наборов прорастающего лука показало, что характер включения отличался в неповрежденных тканях, при этом большая часть радиоактивности происходила в CSO с небольшим указанием на то, что метка была в γGP. до входа во фракцию CSO.Различия, наблюдаемые в ходе этих двух исследований, могут быть вызваны метаболическими различиями между интактными растениями и отделившимися стареющими листьями. Эти эксперименты, тем не менее, предоставили убедительный путь биосинтеза и объяснение взаимосвязи между несколькими соединениями серы, обнаруженными в Allium s. Однако биосинтез в разных тканях и состояниях развития, происхождение алк (ен) ильных групп, а также взаимосвязь между CSO и γGP требуют дальнейшего изучения.

Рис. 2.

Предлагаемый путь биосинтеза аллильных, пропенильных и пропильных групп предшественников ароматизатора Allium (адаптировано из Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989). Показанный путь демонстрирует, как метакрилат может быть преобразован в аллильную, пропильную или пропенильную группу. Другие промежуточные продукты в биосинтезе предшественников ароматизаторов не показаны.

Рис. 2.

Предлагаемый путь биосинтеза аллильных, пропенильных и пропильных групп предшественников ароматизатора Allium (адаптировано из Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989).Показанный путь демонстрирует, как метакрилат может быть преобразован в аллильную, пропильную или пропенильную группу. Другие промежуточные продукты в биосинтезе предшественников ароматизаторов не показаны.

Происхождение заместителей алк (ен) ила

Цистеин, как известно, химически реагирует с метакриловой кислотой с образованием S -2-карбоксипропилцистеина, обеспечивая таким образом путь к алк (ен) ильным группам в ACSO, PeCSO и PCSO. Гранрот (1970) уже показал, что ¹⁴ C-валин дает радиоактивно меченную метакриловую кислоту, которая может реагировать с глутатионом с образованием S -2-карбоксипропилглутатиона. In vivo , метакрилил-КоА является промежуточным звеном катаболизма валина (Zolman et al. , 2001), обеспечивая источник этого материала внутри клетки. На основании этих данных было сделано предположение, что все алк (ен) ильные боковые цепи в CSO (кроме метильной) были образованы из S -2-карбоксипропильной группы посредством декарбоксилирования и восстановления, как показано на рис. 2. В качестве дополнительных доказательств для этого маршрута in vivo , как Granroth (1970), так и Suzuki et al. (1962) идентифицировал включение ¹⁴ C-валина в S -2-карбоксипропилцистеин и S -2-карбоксипропилглутатион.Кроме того, Гранрот (1970) подтвердил, что лук может гидролизовать S -2-карбоксипропилглутатион и что в ткани листьев лука S -2-карбоксипропилцистеин быстро превращается в PeCSO, хотя и без включения радиоактивной метки в S. -2-карбоксипропилглутатион.

Эксперименты для определения способности лука превращать S -2-карбоксипропилцистеин в PeCSO были также проведены Парри и его коллегами. Мечение атома серы и пропильной группы в S -2-карбоксипропилцистеине показало, что луковые растения превращали его в PeCSO без значительных изменений (Parry and Sood, 1989).Эти эксперименты также предоставили информацию об окислительном декарбоксилировании S -2-карбоксипропилцистеина. Тритий в C-2 карбоксипропильной группы оставался в PeCSO, в то время как тритий в C-3 терялся. Это указывает на то, что производное 3-кето- S -2-карбоксипропилцистеина не является промежуточным продуктом в реакции декарбоксилирования. Последующие эксперименты, в которых S -2-карбоксипропилцистеин стереоспецифически тритировали по C-3, доказали, что конфигурация реакции была такой же, как и при декарбоксилировании, связанном с биосинтезом порфирина и терминального алкена у растений (Parry and Lii, 1991).

Есть признаки того, что включение серы в CSO и окисление до сульфоксида осуществляется ферментами с широкой субстратной специфичностью. Биосинтез цистеина путем добавления серы к O -ацетилсерину требует членов семейства цистеинсинтаз, некоторые члены которого, как известно, играют роль во вторичном метаболизме (Ikegami and Murakoshi, 1994). Хотя цистеин может быть алк (ен) илилирован в составе трипептида глутатиона, есть убедительные доказательства того, что это также может происходить во время синтеза одной аминокислоты.Инкубация листьев лука или чеснока с ¹⁴ C-серином и рядом тиолов (включая этантиол, бензолметантиол и 2-тиоэтанол) приводила к синтезу соответствующих замещенных цистеинов с радиоактивной меткой (Granroth, 1970). В целом согласны с этой работой, эксперименты Turnbull et al. (1981) показал, что проникновение ¹⁴ C-серина и ¹⁴ C-цистеина в прорастающие листья лука привело к включению радиоактивности как в MCSO, так и в PeCSO.Добавление серина и либо 2-пропентиола, либо этантиола к культурам корня лука привело к синтезу ACSO и S -этил CSO (Prince et al. , 1997), ни один из которых обычно не синтезируется луком. Однако наблюдение, что доставка меченного радиоактивным изотопом цистеина в ткань лука (Granroth, 1970) всегда приводила к быстрому образованию PeCSO, предполагает, что это происходит непосредственно из цистеина. Если бы перенос тиоалкила на O -ацетилсерин был единственным источником биосинтеза CSO, то маловероятно, что радиоактивные метки попадут в CSO из цистеина.

Доказательства общей природы стадии окисления получены из нескольких исследований, которые демонстрируют окисление экзогенных S -алк (ен) илцистеинов до соответствующего сульфоксида. Гранрот (1970) показал, что S -метилцистеин, S -этилцистеин, S -пропилцистеин и S -пропенилцистеин могут быть окислены до соответствующего сульфоксида тканью лукового листа. Более поздние эксперименты подтверждают этот вывод. Например, ткани лука, чеснока и лука-пучка были способны преобразовывать S -аллилцистеин в ACSO, даже если эти виды не продуцируют ACSO (Ohsumi et al., 1993), с указанием того, что окисление опосредовано стереоспецифическим ферментом. Оксидаза, предложенная Ланкастером и Шоу (1989) для действия на γ-глутамил- S -алк (ен) илцистеины, может, следовательно, также распознавать S -алк (ен) илцистеины.

Контроль биосинтеза предшественников ароматизаторов: биосинтез в культуре тканей

Путь биосинтеза предшественников ароматизаторов в луке и чесноке, по-видимому, не ограничен определенной тканью или типом клеток.Синтез вторичных метаболитов недифференцированными клетками во многих культурах растительных клеток или тканей обычно намного ниже, чем в интактном растении, но изменение условий роста может стимулировать значительное увеличение урожайности (Collin, 2001). Таким образом, исследования с использованием культур тканей лука и чеснока могут дать представление о том, может ли добавление каких-либо предлагаемых биосинтетических промежуточных продуктов стимулировать этапы биосинтеза CSO. Все исследования показывают, что аллииназа присутствует в культурах тканей лука (Davey et al., 1974), но основные предшественники аромата отсутствуют или присутствуют только в небольших количествах в недифференцированной каллусе. Недифференцированные бесцветные каллусы лука и чеснока содержали менее 10% от уровня предшественников аромата в луковицах и почти полностью содержали MCSO (Селби и др. , 1979; Ланкастер и др. , 1988). Следовые количества PeCSO могут быть обнаружены в каллусе лука после инкубации с ¹⁴ C-цистеином или серином (Turnbull et al. , 1981), что указывает на то, что этот путь биосинтеза был активен только в очень ограниченной степени.Имеются сообщения о низких уровнях ACSO и PCSO в недифференцированном каллусе чеснока (Madhavi et al. , 1991), а также о PCSO и PeCSO в каллусе лука-чеснока (Mellouki et al. , 1996), что позволяет предположить, что Allium виды в культуре ткани могут различаться по биосинтетической способности.

Синтез полного спектра предшественников аромата может возобновиться, если каллусам будет позволено повторно дифференцироваться или восстановить способность к фототрофному метаболизму. Как только каллус чеснока снова дифференцировался в зеленые побеги или корни (Lancaster et al., 1988), ткани содержали ACSO, MCSO и PCSO на уровнях, сопоставимых с интактными растениями. Возобновление синтеза предшественника вкуса после повторной дифференцировки каллуса лука на побеги и корни после удаления ауксина 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4, D) было зарегистрировано ранее Turnbull et al. (1981), а ауксин-4-амино-3,5,6-трихлорпиколиновая кислота (пиклорам) индуцировала PeCSO даже на высоких уровнях, которые подавляли явную дифференцировку (Musker et al., 1988).

Добавление доноров S -alk (en) ила или предполагаемых промежуточных продуктов биосинтеза способствует синтезу CSO в тканевых культурах. Очень низкие уровни MCSO и ACSO были обнаружены в побеговых каллюсах чеснока (90 мкМ CSO по сравнению с 6,0 мМ в луковицах) вместе со следовыми количествами S -аллилцистеина и S -метилцистеина (Ohsumi et al. , 1993), но добавление 2-пропентиола к культуральной среде приводило к обнаруживаемым уровням как S, -аллилцистеина, так и ACSO в течение нескольких часов.Недавние эксперименты в нашей лаборатории также продемонстрировали, что как луковые, так и тканевые культуры чеснока способны синтезировать ACSO, если они снабжены 2-пропентиолом или S -аллил-L-цистеином, и PCSO, когда поставляются с пропилтиолом или S — пропил-L-цистеин (J Hughes, неопубликованная работа). Синтез PeCSO может быть аналогичным образом восстановлен до значительных уровней в культуре каллуса лука с помощью S -2-карбоксипропилцистеина или S -пропенилцистеина (Selby et al., 1980). Потенциальные промежуточные продукты, полученные ранее в пути биосинтеза, не имели такого эффекта. Это предполагает, что отсутствие биосинтеза ароматических соединений в культурах ткани лука происходит из-за ингибирования образования S -2-карбоксипропилцистеина.

Таким образом, имеется экспериментальное свидетельство синтеза CSO, протекающего через алк (ен) илилированный свободный цистеин и через S -алк (ен) илилированный глутатион. Вопрос о том, действуют ли оба пути постоянно во всех тканях, еще предстоит решить, но информация о ферментах, необходимых для обоих путей, могла бы помочь в ответе.

Пептидазы и транспептидазы

Связь между γ-глутамилпептидами и алк (ен) илцистеинсульфоксидами, предложенная Ланкастером и соавторами (Lancaster and Shaw, 1989; Lancaster et al. , 1989; Randle et al. , 1995), где первые являются биосинтетическими предшественниками последнего, требуется активность ферментов по удалению глициловых и γ-глутамильных остатков из возникающего алк (ен) илсульфоксида. γ-глутамилтранспептидаза катализирует перенос γ-глутамильной группы от γ-глутамилпептидов либо к аминокислотам, либо к другим пептидам.Этот фермент может также действовать как γ-глутамилпептидаза, требуя только воды в качестве акцептора. У млекопитающих и микроорганизмов он участвует в «γ-глутамиловом цикле» (рис. 3), который разрушает глутатион и участвует в транспорте цистеина (Noctor et al. , 2002). Обе эти активности были обнаружены в водных экстрактах гвоздики и листьев проросшего сорта чеснока Red (Ceci et al. , 1992). Активность ферментов была выше в быстрорастущих листьях. Активность гамма-глутамилпептидазы была зафиксирована в листьях лука-чеснока и снизилась до 5% от этого уровня в клеточных культурах (Mellouki et al., 1996). Добавление экзогенной пептидазы увеличивало выход аллииназной реакции из культур клеток лука-чеснока, предполагая, что недостаток γ-глутамилтранспептидазы также может быть причиной низких уровней предшественников аромата в культуре тканей.

Рис. 3.

Предлагаемые пути деградации глутатиона у растений и животных. (Адаптировано из Leustek et al. , 2000; Noctor et al. , 1998.) Путь A (слева) указывает на γ-глутамиловый цикл у животных.Путь B (справа) указывает на второй путь, который существует по крайней мере в некоторых растениях.

Рис. 3.

Предлагаемые пути деградации глутатиона у растений и животных. (Адаптировано из Leustek et al. , 2000; Noctor et al. , 1998.) Путь A (слева) указывает на γ-глутамиловый цикл у животных. Путь B (справа) указывает на второй путь, который существует по крайней мере в некоторых растениях.

Активность γ-глутамилпептидазы была обнаружена в листьях, корнях и луковицах растущего лука, но не в спящих луковицах разновидности Саутпорт Уайт Глоб (Lancaster and Shaw, 1991).Однако он был обнаружен в хранящихся луковицах лука сорта Спартан Баннер, когда они хранились при 20 ° C в течение 8 месяцев. Активность постепенно увеличивалась с четвертого месяца в магазине (Hanum et al. , 1995). Измерение сульфоксида γ-глутамилпропенилцистеина и PeCSO в луковицах семи сортов лука при хранении в прохладном месте в течение 4 месяцев показало постепенное снижение уровней сульфоксида γ-глутамилпропенилцистеина и повышение уровней PeCSO (Kopsell et al. , 1999).Исследование луковиц показало, что некоторые из них оставались бездействующими во время хранения, в то время как другие сорта выходили из состояния покоя после первого месяца. Очевидно, что сорта лука различаются по характеристикам хранения, и это может объяснить разные результаты по активности γ-глутамилтранспептидазы, обнаруженные в этих исследованиях.

В прорастающих луковицах лука это связано с гидролизом и ремобилизацией γGP. Γ-глутамилтранспептидаза была частично очищена из лука (Lancaster and Shaw, 1994), который проявлял как пептидазную активность, которая не зависела от pH, так и активность транспептидазы, которая существенно повышалась при pH выше 8.0. Он показал значения K _m между 0,4 мМ и 2,0 мМ для нескольких производных γ-глутамила и значение K _m для глутатиона 5 мМ. Его субстраты включали γ-глутамилметилцистеин, γ-глутамилпропенилцистеин, 2-карбоксиглутатион и сульфоксид γ-глутамилпропенилцистеина, причем для последних двух значений K _m были ниже расчетных клеточных концентраций (Lancaster and Shaw , 1994). Если гидролиз γ-глутамиловой части сульфоксидов γ-глутамилалк (ен) илцистеина требовался во время синтеза CSO в этих тканях, этот фермент мог быть задействован, и эксперименты in vitro показали, что он обладает широкой субстратной специфичностью.Имеются также данные о другом пути деградации глутатиона у некоторых растений (рис. 3B), который начинается с удаления остатка глицина из глутатиона, а не глутамильной группы (Leustek et al. , 2000).

Контроль биосинтеза предшественников ароматизаторов: влияние подачи и хранения серы и азота

Очевидно, что для биосинтеза ароматических соединений требуется значительное количество серы. При коммерческом производстве лука обычно считается, что на остроту влияет сера, при этом более высокая доступность серы, как правило, приводит к большей интенсивности вкуса.Существует коммерческий интерес к выращиванию мягкого лука, и это обычно предполагает использование соответствующих сортов лука в среде с низким содержанием серы (Randle et al. , 1995). Исследования влияния этих режимов роста на вкус дают некоторую информацию о биосинтезе аромата. Влияние на накопление серы и уровни ароматических соединений в луке при изменении среды роста предполагает, что MCSO ведет себя иначе, чем PeCSO.

Хотя PeCSO является основным CSO в луке, синтез MCSO можно улучшить, изменив условия выращивания за пределами диапазонов, обычно встречающихся в сельском хозяйстве.К ним относятся низкий уровень серы (S) и высокий уровень азота (N). Исследование 16 сортов лука короткого дня, выращенных в искусственной почвенной среде с двумя уровнями содержания серы (в виде сульфата, 2,0 мМ и 0,05 мМ), показало, что, хотя луковицы, выращенные с более высоким уровнем серы, содержали больше предшественников аромата (Randle and Bussard, 1993), было мало корреляции между уровнями серы в почве и предшественниками ароматизаторов (измеренными как ферментативно генерируемый пируват). Однако более позднее исследование только трех сортов лука (Рио-Гранде, Саванна Свит и Саутпорт Уайт Глоб) дало более подробную картину.Эти луковицы выращивали на песке, поддерживающем пять уровней сульфата (Randle et al. , 1995). При самом низком уровне сульфата (0,05 мМ) все сорта демонстрировали симптомы дефицита серы, но почти 95% общей серы в луковице можно было отнести к MCSO, PCSO и PeCSO и сульфоксиду γ-глутамилпропенилцистеина, что указывает на биосинтез предшественника вкуса. был сильным поглотителем серы даже при недостатке серы. При наивысшем уровне использованного сульфата (1,55 мМ) менее 40% серы в луковице могло быть отнесено к этим соединениям и, вместо этого, должно было присутствовать в компонентах пути биосинтеза ароматизатора, которые не были измерены, или в других органических соединениях серы. .

В более позднем исследовании было обнаружено значительное количество сульфата в луковицах этих трех сортов, которое увеличивалось по мере увеличения уровня сульфата в искусственной питательной среде (Randle et al. , 1999). Общее количество серы в луковицах всех трех сортов было одинаковым на каждом уровне сульфата в среде и увеличивалось по мере увеличения уровней. Уровень CSO (измеренный как ферментативно генерируемый пируват) также увеличивался в ответ на увеличение содержания сульфата в среде для выращивания, но уровни отдельных CSO были разными для трех сортов.MCSO преобладала при самых низких уровнях сульфата во всех трех сортах и ​​оставалась аналогичной или уменьшалась по мере увеличения содержания сульфата в среде. Выше 0,425 мМ уровень PeCSO повышался до уровня MCSO или превышал его. Саутпорт Уайт Глоуб имел более низкий уровень PeCSO, чем два других сорта, на который не повлияло увеличение содержания сульфата. Уровни PeCSO в Рио-Гранде были выше, но также не подвержены влиянию сульфатов в окружающей среде. Однако уровни в Savannah Sweet неуклонно снижались по мере увеличения содержания сульфата.McCallum et al. (2002) наблюдали изменения в уровнях транскриптов нескольких генов, необходимых для поглощения и ассимиляции сульфатов (APS-редуктаза, АТФ-сульфурилаза, высокоаффинный переносчик сульфата и сульфитредуктаза) в ответ на временное или долгосрочное лишение серы сортов лука Canterbury Longkeeper и Houston Grano, указывающие на то, что регулирование этих начальных стадий ассимиляции серы также лежит в основе различий во вкусе лука.

Для выращивания перезимованного лука с мягким вкусом на супесчаной почве в регионе Видалия, США, применение удобрений, содержащих S , не рекомендуется с весны, так что лук будет испытывать среду с пониженным содержанием серы. .Сульфат применяется зимой, чтобы обеспечить хороший рост корней и листьев. При исследовании графика вывода сульфата сорт Sweet Vidalia выращивали в искусственной среде, где начальный уровень 1 мМ сульфата был снижен до 0,05 мМ для шести групп растений с последовательными двухнедельными интервалами (Randle et al. ). , 2002). Анализ содержания серы в листьях и луковицах при сборе урожая показал, что было больше серы в луковицах или листьях, где более высокий уровень серы сохранялся до ближайшего времени сбора урожая.Уровни CSO (измеренные как ферментативно генерируемый пируват) также были выше в луковицах, выдерживаемых при концентрации 1 мМ сульфата дольше. Однако анализ отдельных CSO и сульфоксида γ-глутамилпропенилцистеина показал, что, хотя низкие уровни PCSO не зависели от снижения содержания сульфата, уровни γ-глутамилпропенилцистеинсульфоксида и PeCSO увеличивались в луковицах растений, поддерживаемых на более высоком уровне. сульфата дольше. Уровни MCSO были постоянно самыми высокими, но снижались, когда вывод сульфата откладывался.Различное поведение трех предшественников аромата было очень очевидным.

Метаболизм серы тесно связан с метаболизмом азота через выработку аминокислоты цистеина как первого органического соединения серы при ассимиляции серы. Таким образом, подача азота может влиять на поглощение серы и образование CSO. Интересно, что N, по-видимому, не влияет на уровень неорганической S (измеряемой в виде сульфата) в луковицах, а вместо этого изменяет уровни некоторых ассимилятов серы.Когда сорт лука Granex 33 был выращен гидропонно с 250 мг на литр ^-1 S и 20-140 мг на литр ^-1 N (из нитрата аммония), хотя уровень неорганической серы в луковицах не был затронут, органическая сера в луковицах оставалась неизменной. луковиц увеличивалось, когда количество серы в гидропонной среде увеличивалось примерно до 80 мг / л ^-1 N, но впоследствии уменьшалось (Coolong and Randle, 2003 a ). Анализ CSO и γGP показал, что основной эффект был на сульфоксид γ-глутамилпропенилцистеина, где уровни увеличивались примерно в 10 раз до 80 мг / л ^-1 N, а затем существенно снижались.Уровни PCSO практически не пострадали, но MCSO постоянно увеличивалась по мере увеличения внешнего уровня азота. PeCSO также находился под влиянием, немного увеличиваясь, когда уровень азота в гидропонной среде повышался до 80 мг / л ^-1 N, но затем немного снижался. Как следствие, PeCSO вносил основную долю предшественников ароматизатора при более низких уровнях азота (20–56 мг на л ^-1 N), а MCSO был основным компонентом выше 80 мг на литр ^-1 Н. Разница в поведении между Интересны три предшественника аромата, так же как и тот факт, что действительно основное влияние было на уровни γGP, а не CSO.

В дополнение к этому исследованию уровень серы и азота, доступный для сорта Granex 33 по мере его созревания в гидропонной культуре, варьировался (5, 45 и 125 мг л ^-1 S в виде сульфата; 10, 50, 90 и 130 мг / л ^-1 N нитрата аммония). Самый низкий уровень азота привел к появлению симптомов дефицита, включая пожелтение листьев и небольших луковиц, содержащих меньшее количество N, S, CSO и γGP, чем после всех других обработок (Coolong and Randle, 2003 b ).При самом низком уровне N (10 мг / л ^-1 ) уровни MCSO, PCSO и γGP в луковицах оставались низкими и неизменными, независимо от поступления серы. Единственным исключением были уровни PeCSO. Это было выше в среде с дефицитом азота при самом низком уровне серы, чем при более адекватной подаче азота. Уровни MCSO были постоянно выше, чем у PeCSO. Это указывает на то, что поступление азота, а не серы, оказывает большее влияние на уровни MCSO. Различные эффекты поставки S на PeCSO и γGP предполагают, что их синтез находится под разным контролем.

Еще одно исследование, которое показало различное поведение MCSO и PeCSO, проводилось во время хранения луковиц лука более 4 месяцев. За это время уровни PeCSO увеличились во всех шести сортах лука, в то время как уровни MCSO остались практически такими же или снизились (Kopsell et al. , 1999).

Тканевое и субклеточное расположение

Имеется ограниченная информация о том, где синтезируются предшественники ароматизаторов, и это обобщено для местоположений внутри ячейки на рис.4. После выделения хлоропластов, митохондрий и цитоплазмы из эпидермиса листьев прорастающих луковиц лука глутатион был идентифицирован в хлоропластах и ​​цитоплазме, в то время как CSO и γGP располагались только в цитоплазме, а γ-глутамилцистеин — в хлоропластах ( Lancaster и др. , 1989). Также было идентифицировано расположение нескольких активностей ферментов, необходимых для биосинтеза. Один из ферментов, необходимых для биосинтеза глутатиона, γ-глутамилцистеинсинтетаза, находится в хлоропластах, тогда как γ-глутамилтранспептидаза находится в цитоплазме, хотя небольшая часть может быть связана с пероксисомами.

Рис. 4.

Субклеточное расположение промежуточных продуктов биосинтеза, предшественников ароматизаторов и аллииназы в Allium s. Местонахождение основано на данных по луку и чесноку, а также на местонахождении подобных ферментов в других растениях. У лука аллииназа присутствует в вакуоли всех клеток. В чесноке аллииназа присутствует только в вакуоли клеток оболочки пучка. Не в масштабе.

Рис. 4.

Субклеточное расположение промежуточных продуктов биосинтеза, предшественников ароматизаторов и аллииназы в Allium s.Местонахождение основано на данных по луку и чесноку, а также на местонахождении подобных ферментов в других растениях. У лука аллииназа присутствует в вакуоли всех клеток. В чесноке аллииназа присутствует только в вакуоли клеток оболочки пучка. Не в масштабе.

Зрелые клетки луковицы луковицы большие и тонкостенные с тонким периферическим слоем цитоплазмы, выстилающей внутреннюю часть стенки. Большая центральная вакуоль занимает большую часть объема клетки. Электронная микроскопия показала наличие мелких пузырьков как в цитоплазме, так и в центральной вакуоли (Turnbull et al., 1981). Выделение вакуолей из чешуек внутренней луковицы показало, что литический фермент аллииназа изолирован внутри вакуоли, в то время как предшественники аромата находятся в цитоплазме (Lancaster and Collin, 1981). Дальнейшее исследование (Lancaster et al. , 1989) субклеточной локализации в луке подтвердило эти результаты. Прорастающие листья лука инкубировали с ³⁵ S-сульфатом в течение 1 дня для мечения предшественников ароматизатора. CSO были обнаружены в цитоплазматической фракции.Свидетельством того, что аллииназа была изолирована в вакуоли, был сильный запах лука, который обнаруживался при лизировании протопластов и вакуолей.

В отличие от лука, аллииназа в чесноке ограничена определенными типами клеток. Запасной орган лука состоит из чешуек, образовавшихся от набухших оснований листьев, тогда как у чеснока он образован от набухших боковых почек. Зубчики чеснока содержат сильно вакуолизированные клетки паренхимы как запасной мезофилл, перемежающийся с сосудистыми пучками. Когда свежие срезы гвоздики рассматривали в синем свете (Ellmore and Feldberg, 1994), наблюдалась сильная желто-зеленая автофлуоресценция от клеток оболочки пучка, а не от клеток любого другого типа.Эти клетки образовывали слой толщиной от одной до четырех клеток вокруг сосудистых пучков. Флуоресценцию приписывают кофактору пиридоксаль-5′-фосфата, присутствующему в аллииназе. Это было подтверждено окрашиванием срезов зубчиков чеснока на активность аллииназы, где клетки оболочки пучка стали плотно окрашены, с указанием того, что пятно было в вакуоли (Ellmore and Feldberg, 1994). Поликлональные антитела к аллииназе также интенсивно окрашивали внутреннюю часть клеток оболочки пучка. Окрашивание соседнего запасающего мезофилла, хотя и присутствовало, было намного слабее, и не было окрашивания клеток мезофилла, более удаленных от сосудистых пучков.Это клеточно-специфическое расположение аллииназы в чесноке отличается от ситуации в луке, где данные свидетельствуют о том, что она присутствует в вакуолях всех клеток луковиц и листьев.

Луковицы лука луковицы появляются в течение 4–6 недель, когда растение увеличивается в весе в 3–4 раза. Ланкастер и его коллеги проследили изменения в предшественниках вкусовых добавок, которые произошли во время этого процесса (Lancaster et al. , 1986). Белые нефотосинтетические основания листьев набухают, образуя луковицу в виде ряда концентрических чешуек.Новые чешуйки луковицы быстро расширяются в центре развивающейся луковицы, тогда как более старые стареют так же быстро, образуя внешние бумажные защитные слои. Анализ предшественников аромата в листьях и чешуях луковиц развивающихся луковиц показал, что предшественники аромата перемещались от листовой пластинки к ее основанию по мере развития чешуек луковицы (Lancaster et al. , 1986). Листовые пластинки содержали большое количество всех трех предшественников аромата до образования луковиц, но по мере развития луковиц уровни упали на 90%, и только PCSO оставалось в значительных количествах.По мере созревания луковицы предшественники аромата были потеряны из внешних стареющих чешуек, и PCSO увеличилось в центральных чешуях, хотя уровни MCSO и PeCSO упали. Самые внутренние чешуйки луковицы не имели прикрепленных листовых пластинок, но содержали предшественники аромата. Анализ базальной пластинки луковицы обнаружил значительное количество предшественников аромата, что указывает на то, что это может быть путь движения между чешуей. При исследовании трех различных сортов лука (Hysam, Durco и Grano de Oro) Bacon et al. (1999) определила, что PeCSO был основным предшественником ароматизатора, и его уровень повышался во внутренних мясистых слоях, а также в верхней и нижней части луковиц после 6 месяцев хранения при 0–0,5 ° C. Уровни предшественников аромата были выше во внутренних мясистых слоях луковиц, а также в верхнем и нижнем сантиметрах луковиц, чем в двух внешних мясистых слоях луковиц.

Ферменты, которые могут участвовать в биосинтезе предшественника ароматизатора

Вторичные метаболические пути могут осуществляться через более чем один компартмент или тип клеток.Это может быть необходимо для регуляции или функции метаболита, но также может быть результатом эволюционного происхождения ферментов (Pichersky and Gang, 2000). Новый фермент возникнет как разновидность существующего фермента, который использовал аналогичный субстрат и катализировал образование аналогичного продукта. Некоторые из ферментов, которые были предложены для катализирования стадий биосинтеза ароматических соединений в Allium s, являются членами больших семейств, которые выполняют очень разнообразные функции. При вторичном метаболизме единственный способ однозначно определить функцию продукта гена в настоящее время — продемонстрировать его ферментативную активность.Было проведено очень мало исследований ферментов из Allium s, которые были бы необходимы для синтеза предшественников ароматизаторов. Следовательно, будет представлена ​​информация о метаболизме глутатиона и цистеина и C-S-лиазах с указанием аспектов, которые могут иметь отношение к ролям в биосинтезе предшественника ароматизатора Allium .

Глутатион и глутатион-

Прекурсоры аромата Allium s — одно из немногих мест, где конъюгаты глутатиона, как полагают, играют роль в эндогенном метаболизме растений.Обе стадии, предложенные для конъюгации глутатиона с метильными, 2-карбоксипропильными или метакрилатными группами, и последующая деградация глутатионовой части с образованием CSO имеют параллели в метаболизме глутатиона, который изучался на других растениях. Глутатион синтезируется как в цитозоле, так и в хлоропласте, и это согласуется с доступностью цистеина (Noctor et al. , 2002). Он не продуцируется с одинаковой скоростью всеми тканями и типами клеток растений. Например, трихомы на стеблях и листьях некоторых экотипов Arabidopsis thaliana демонстрируют гораздо более высокую экспрессию ферментов, участвующих в синтезе цистеина и глутатиона, и имеют более высокие уровни глутатиона, чем окружающие клетки (Gutierrez-Alcala et al., 2000). Если для синтеза CSO требуется глутатион, контроль синтеза глутатиона в Allium s вполне может отражать потребность в гораздо более высоком потоке, чем в других растениях.

Глутатион- S -трансферазная активность в Allium s детально не изучена. Он был обнаружен в эпидермальной ткани луковиц лука. Он присутствовал как в цитозольной, так и в микросомальной фракциях, и анализы с серией субстратов показали, что ферменты в каждом компартменте имели различную специфичность (Schröder and Stampfl, 1999).Когда конъюгация с флуоресцентным субстратом монохлорбиманом наблюдалась под микроскопом в эпидермальных полосках, флуоресценция была очевидна в цитоплазме и ядре, за которой следовала яркая и увеличивающаяся флуоресценция в вакуоли, когда конъюгат транспортировался туда.

Глутатион- S -трансферазы представляют собой большое и древнее суперсемейство ферментов, где N-концевой сайт связывания глутатиона лучше консервативен, чем C-концевой сайт связывания совместного субстрата. Экспрессия специфических глутатион- S -трансфераз заметно варьирует во время развития растений, деления клеток и старения (Marrs, 1996).Роль глутатион- S -трансфераз в детоксикации ксенобиотиков, таких как гербициды, широко изучалась (обзор Marrs, 1996; Coleman et al. , 1997). Они действуют совместно с другими ферментами, выводя токсины из ксенобиотиков за счет конъюгации с глутатионом для повышения растворимости в воде. Это опосредуется глутатион- S -трансферазами в цитозоле, и затем конъюгат транспортируется в вакуоль или апопласт с помощью транспортеров, расположенных внутри тонопласта или плазматической мембраны.Вакуолярная карбоксипептидаза может отщеплять глицин от конъюгатов глутатион- S , а дипептидаза может удалять глутамильную группу, оставляя цистеиновый конъюгат (цитируется в Coleman et al. , 1997). Отток конъюгатов цистеина из вакуоли сопровождается дальнейшим метаболизмом C-S-лиазами в цитозоле. Метаболиты, продуцируемые этим процессом, могут экспортироваться в апопласт и связываться с лигнином и целлюлозой (Coleman et al. , 1997).

Биосинтез предшественников ароматизатора Allium может быть примером использования этой системы для синтеза вторичных метаболитов, хотя, по-видимому, задействованы разные клеточные компартменты.Как показано на рис. 4, аллииназа изолирована в вакуоли, а не в цитоплазме, а CSO находятся в цитоплазме (Lancaster and Collin, 1981) или в небольших цитоплазматических пузырьках (Edwards et al. , 1994). Хотя сульфоксиды γ-глутамилалк (ен) илцистеина не являются субстратами для аллииназы, если они обрабатываются в вакуоли, им может потребоваться защита от аллииназы перед экспортом в цитоплазму. В этом контексте наблюдение, что аллииназа образует стабильный комплекс с лектином в чесноке (Rabinkov et al., 1995; Смец и др. , 1997). Эти два являются основными белками зубчиков чеснока, и хотя нет никаких доказательств того, что этот комплекс существует in vivo , он может обеспечить средства для дальнейшего отделения аллииназы от ее субстрата.

Синтез цистеина

Требование высоких уровней продукции цистеина в Allium s предполагает, что регуляция биосинтеза цистеина может отличаться от других растений.Кроме того, исследования включения серина и тиолов в Allium s (Granroth, 1970; Ohsumi et al. , 1993; Prince et al. , 1997) показывают, что биосинтез цистеина может обеспечить путь для синтеза некоторых S -алк (ен) ил цистеинов.

Заключительная стадия синтеза цистеина катализируется двумя последовательными ферментами, серинацетилтрансферазой (SAT (EC 2.3.1.30) и цистеинсинтазой (Leustek et al. , 2000). Это стадия, на которой неорганическая сера включается в первое органическое соединение серы в клетке, а также точка, в которой пути ассимиляции углерода и азота встречаются с ассимиляцией серы.После добавления O -ацетильной группы к серину с помощью SAT образуется аминоакрилатный аддукт O -ацетилсерина, связанный с пиридоксаль-5′-фосфатным кофактором CS. Он реагирует со вторым субстратом, сульфидом, с образованием цистеина, который высвобождается (Warrilow and Hawkesford, 2002). Каталитический механизм CS с промежуточным соединением, связанным с ферментом, обеспечивает возможности для развития активного центра для размещения различных заместителей.

Растения содержат семейства SAT и CS с цитозольными, хлоропластическими и митохондриальными изоформами (Inoue et al., 1999). Причина множественных форм и их наличие в отдельных органеллах неясна. С точки зрения синтеза предшественников ароматизатора Allium наиболее интересным аспектом является то, что некоторые CS обладают более широкой субстратной специфичностью, чем один сульфид. Фермент принадлежит к семейству β-замещенных аланинсинтаз, и существует несколько примеров активности CS с вторичной, а не первичной метаболической ролью (Ikegami and Murakoshi, 1994). Вид Mimosa L.и Leucaena Benth. накапливают мимозин, а представители семейства тыквенных, такие как арбуз ( Citrullus vulgaris Schrad.), содержат β-пиразол-1-илаланин. Оба этих вторичных метаболита образуются CS путем связывания пиразола или 3,4-дигидроксипиридина с O -ацетилсерином. Другие гетероциклические β-замещенные аланины были идентифицированы в составе других видов растений, помимо метаболитов регуляторов роста зеатина и 6-бензиламинопурина, а также ксенобиотиков, таких как триазольные гербициды (Ikegami and Murakoshi, 1994), которые все могут быть синтезированы путем конденсации соответствующее N -гетероциклическое соединение с O -ацетилсерином, опосредованное CS из видов растений, где вторичный метаболит встречается в природе.

В условиях анализа in vitro CS может использовать множество других соединений в качестве акцептора для аланильной части из O -ацетилсерина. Когда представлены подходящие субстраты, CS, очищенные от Leucaena leucocephala Lam. (De Wit), Pisum sativum L., Citrullus vulgaris , Spinacia oleracea , Lathyrus latifolius L., Lathyrus sativus L. и Allium tuberosum Rottl. ex Spreng.все были способны синтезировать S -метилцистеин, S -аллилцистеин и S -карбоксиметилцистеин со скоростью от 1% до 72% от таковой для синтеза цистеина (Ikegami and Murakoshi, 1994). С другими субстратами ферменты CS этих видов образовывали другие небелковые β-замещенные вторичные метаболиты аланина in vitro (Ikegami and Murakoshi, 1994).

SAT и CS из A. tuberosum были подробно изучены (Ikegami et al., 1993; Урано и др. , 2000). Два CS были очищены из листьев, которые не показали ингибирования O -ацетилсерином в концентрациях до 25 мМ. Оба они были способны синтезировать S -замещенные цистеины, а также β-цианоаланин, хотя и со скоростью менее 10% от цистеина в тех же условиях (Ikegami et al. , 1993). Субстраты, используемые этими ферментами, очень похожи на субстраты, используемые ферментом Spinacia oleracea .Измерение чувствительности SAT A. tuberosum к цистеину показало, что концентрация для 50% ингибирования составляла 48,7 мкМ, что было промежуточным между значениями, обычно получаемыми для чувствительных к обратной связи (<5 мкМ) и нечувствительных (> 100 мкМ) ферментов (Urano и др. , 2000). Уровни цистеина в A. tuberosum , около 45 нмоль на г ^-1 сырого веса, были оценены в 5–6 раз выше, чем в Nicotiana tabacum L. или Arabidopsis thaliana .Интересно, что уровни окисленного и восстановленного глутатиона у трех растений были сопоставимы. Более высокий уровень цистеина в A. tuberosum можно объяснить низкой чувствительностью SAT к ингибированию цистеина или другими факторами в обороте цистеина, необходимыми для удовлетворения спроса на биосинтез предшественника ароматизатора. Работа в нашей лаборатории показала, что чеснок имеет несколько CS, которые различаются по экспрессии в тканях и способности синтезировать S -аллил цистеин (A Tregova, J Hughes and J Milne, неопубликованная работа).

Продукция O -ацетилсерина с помощью SAT из Citrullus vulgaris (арбуз) проявляет ингибирование цистеином на физиологических уровнях (50% ингибирование при 2,9 мкМ), но не подвергается влиянию вторичного метаболита β-пиразол-1- илаланин даже в концентрации 1 мМ (Saito et al. , 1995), что позволяет предположить, что фермент ведет себя по-разному в регулировании поставки O -ацетилсерина для выполнения своих первичных и вторичных метаболических ролей. Синтез цистеина можно жестко регулировать, тогда как синтез β-пиразол-1-илаланина на этой стадии не контролируется.Если CS участвует в биосинтезе предшественников ароматизатора Allium , возможно, что подобная регуляторная система может быть задействована.

Последний пример цистеина в синтезе соединений, аналогичных предшественникам ароматизатора Allium , происходит из механизма толерантности к селену, обнаруженного у некоторых растений. Сера и селен химически подобны, и, таким образом, селен может быть включен в соединения, которые должны содержать серу, что приводит к проблемам токсичности.Анализ селенсодержащих летучих веществ из лука, чеснока, A. tuberosum и A. ampeloprasum L. показал, что Se-метильные соединения преобладают, несмотря на обилие других соединений S -алк (ен) ила в растения (Cai et al. , 1994). В некоторых ситуациях происходит различие между этими двумя элементами, и один из них заключается в синтезе Se-метил селеноцистеина в механизме толерантности растений Fabaceae, которые накапливают высокие уровни селена (Ellis and Salt, 2003).Растения синтезируют Se-метил селеноцистеин, γ-глутамил-Se-метил селеноцистеин и другие производные селена небелковых аминокислот, которые можно рассматривать как селеновые аналоги S -алк (ен) илцистеина и γ-глутамил- алк (ен) ил цистеиновые пептиды. Идентификация тиол / селенолметилтрансферазы из Astragalus bisulcatus (Neuhierl et al. , 1999) прояснила биосинтез этих метаболитов. Экспрессия фермента в Escherichia coli показала, что его субстратами были S -метилметионин и селеноцистеин, а активность с цистеином была близка к пределам обнаружения анализа.Хотя этот фермент из A. bisulcatus не может синтезировать S -метилцистеин, синтез этих метилированных и γ-глутамилированных аминокислот представляет собой интересную параллель с биосинтезом предшественника ароматизатора в Allium s.

Аллииназа и лиазы C-S

C-S-лиазы в растениях участвуют в первичном и вторичном метаболизме, расщепляя связи между атомами серы и углерода, и являются частью более крупного семейства аминотрансфераз.Члены включают аллииназу, а также цистатионин и цистинлиазы, цистеин-десульфидразу и ферменты, участвующие в детоксикации ксенобиотиков после конъюгации с глутатионом, а также, вероятно, другие, участвующие в биосинтезе глюкозинолатов и цианогенных глюкозидов (Kiddle et al. , 1999). Есть признаки того, что луковая аллииназа предпочтительно гидролизует PeCSO, а не MCSO или PCSO, поэтому PeCSO вносит больший вклад в аромат лука, чем два других предшественника (Nock and Mazelis, 1987; Coolong and Randle, 2003 b ).

Трехмерная кристаллическая структура аллииназы была решена с разрешением 1,5 Å в 2002 г. (Kuettner et al. , 2002). Это показало, что каждый 448 аминокислотный мономер фермента содержит три домена. Центральный и С-концевой домены имеют складчатую структуру, типичную для других C-S лиаз и аминотрансфераз. Центральный домен типичен для пиридоксаль-5′-фосфатзависимых ферментов класса 1. N-концевой домен отличает структуру аллииназы от других C-S лиаз и аминотрансфераз благодаря наличию EGF-подобного домена.Этот тип домена часто взаимодействует с другими белками и обычно содержит три дисульфидных мостика, образованных между остатками цистеина. Они редко встречаются в растительных белках, и аллииназа является первой, где EGF-подобный домен сливается с каталитическим доменом, а не как внеклеточная часть мембраносвязанного или секретируемого белка. Однако вакуолярное расположение аллииназы требует процесса транспорта после синтеза, который может обеспечивать функцию этого домена.

Источники алк (ен) ильных групп в прекурсорах ароматизатора

Хотя очевидно, что ряд тиолов может быть источником S -алк (en) ильных групп для ферментов CS in vitro (Ikegami and Murakoshi, 1994), в срезах ткани или в тканевой культуре (Granroth, 1970; Prince et al., 1997), неизвестно, играют ли они эту роль in vivo. Растительные ацил-активирующие ферменты особенно плохо охарактеризованы (Shockey et al. , 2003), и даже некоторые из этих параллельно хорошо охарактеризованных ферментов млекопитающих, по-видимому, играют разные роли. Arabidopsis thaliana , по-видимому, имеет 63 организма, что больше, чем у любого другого полностью секвенированного организма на сегодняшний день, предлагая большие возможности для опосредования стадий вторичного метаболизма, с возможностью того, что некоторые или их гомологи в Allium s могут выполнять неуловимый перенос алк (ен) ила в биосинтезе предшественника ароматизатора Allium (Shockey et al., 2003). Селеноцистеинметилтрансфераза из Astragalus bisulcatus , которая использует S -метилметионин для метилирования селеноцистеина, а не цистеина (Neuhierl et al. , 1999), является одним из примеров специализированной активности.

Метакрилат, предложенный в качестве предшественника аллильной, пропильной и пропенильной групп (Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989), встречается внутри клетки во время распада валина жирной кислоты с разветвленной цепью, вероятно, внутри пероксисомы растения.Реакционноспособный интермедиат метакрилил-КоА временно образуется во время этого процесса и может реагировать с нуклеофилами, такими как свободные тиолы (Zolman et al. , 2001). Хотя было выявлено заболевание человека, вызванное накоплением этого реактивного промежуточного продукта в митохондрии, у Arabidopsis thaliana тот же самый дефект вызывает устойчивость к ауксину и дефекты β-окисления в пероксисоме. Результат может быть другим в пероксисомах, где метакрилил-КоА синтезируется в регулируемом процессе с обильным поступлением тиолов из цистеина или глутатиона.

Еще один пример возможного происхождения аллильной группы, характерной для чеснока, — это более 120 вторичных метаболитов глюкозинолатов, обнаруженных в Brassicaceae, Capparaceae и Caricaceae (Fahey et al. , 2001). Биосинтез основной структуры глюкозинолата включает конъюгацию модифицированной аминокислоты с донором серы, предположительно цистеином, с последующим расщеплением, вероятно, CS-лиазой, с получением серосодержащего продукта, который впоследствии глюкозилируется и сульфатируется (Wittstock and Halkier , 2002).Может происходить очень обширная модификация аминокислоты, включая создание аллильной группы. Между окислением модифицированной аминокислоты цитохромом P ₄₅₀ с образованием альдоксима и образованием тиогидроксимовой кислоты перед гликозилированием не было идентифицировано ни промежуточных продуктов, ни ферментов. Хотя активность C-S-лиазы, полученная из листьев Brassica napus , была способна расщеплять потенциальные промежуточные продукты биосинтеза, также использовались другие неприродные субстраты, что позволяет предположить присутствие нескольких ферментов (Kiddle et al., 1999). Замена сульфгидрильной группы цистеина и расщепление C-S-лиазой имеет очевидные параллели с ароматической системой Allium , которую можно было бы исследовать.

Заключительные замечания

Таким образом, понимание биосинтеза ароматизаторов в Allium s является захватывающим моментом. Биосинтетический путь, предложенный Ланкастером и его коллегами, обеспечил жизненно важную основу для интеграции результатов исследований на срезах тканей, культуре тканей и интактных растениях, хотя взаимосвязь между CSO и γGP до сих пор полностью не решена.Исследования эффектов серного питания дополнили современные знания о поведении каждого предшественника вкуса. Накапливается информация, позволяющая предположить, что биосинтез MCSO и, возможно, каждого предшественника аромата может регулироваться по-разному и может не идти одним и тем же путем во всех физиологических условиях. Пониманию этой интригующей области вторичного метаболизма будет способствовать растущее знание метаболизма глутатиона и цистеина в других растениях, в частности Arabidopsis thaliana , что дает параллели для исследования.Следующим этапом будет идентификация и изучение большего количества ферментов и генов в Allium s, которые участвуют в биосинтезе предшественников вкуса. Цистеинсинтазы являются очевидными мишенями, как и ферменты метаболизма глутатиона. Неуловимые источники характерных алк (ен) ильных групп Allium остаются неизвестными, и их идентификация является одновременно проблемой и целью.

Мы благодарны за обсуждение с коллегами и финансовую поддержку проекта ЕС «Чеснок и здоровье», QLK1-CT-1999-00498.

Список литературы

Анкри С., Мирельман Д.

1999

Микробы и инфекции

1

125

Bacon JR, Moates GK, Ng A, Rhodes MJC, Smith AC, Waldron KW.

1999

Пищевая химия

64

257

Блок E.

1992

Angewandte Chemie

31

1135

Brodnitz MH, Pascale СП.

1971

Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии

19

269

Cai XJ, Uden PC, Block E, Zhang X, Quimby BD, Sullivan JJ.

1994

Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии

42

2081

Ceci LN, Curzio OA, Pomilio AB.

1992

Фитохимия

31

441

Коулман Джод, Блейк-Калфф ММА, Дэвис ТГЭ.

1997

Тенденции в растениеводстве

2

144

Коли-Смит младший.

1986

Патология растений

35

362

Collin HA.

2001

Положение о выращивании растений

34

119

Coolong TW, Randle WM.

2003

Журнал продовольственной науки и сельского хозяйства

83

477

Coolong TW, Randle WM.

2003

Журнал Американского общества садоводческих наук

128

776

Дэви М.Р., Маккензи И.А., Фриман Г.Г., Шорт К.С.

1974

Письма о растениеводстве

3

113

Эрншоу DM, McDonald MR, Boland GJ.

2000

Канадский журнал патологии растений

22

387

Эдвардс SJ, Бриттон G, Collin HA.

1994

Ткани и культура клеток растений

38

181

Ellis DR, Salt DE.

2003

Текущее мнение по биологии растений

6

273

Ellmore GS, Feldberg RS.

1994

Американский журнал ботаники

81

89

Fahey JW, Zalcmann AT, Talalay P.

2001

Фитохимия

56

5

Фенвик Дж., Хэнли А.

1985

Критические обзоры пищевой науки и питания

22

199

Gmelin R, Huxa H-H, Roth K, Höfle G.

1976

Фитохимия

15

1717

Гранрот Б.

1970

Annales Academiae Scientiarum Fennicae

154

1

Gutierrez-Alcala G, Gotor C, Meyer AJ, Fricker M, Vega JM, Romero LC.

2000

Proceedings of the National Academy of Sciences, USA

97

11108

Hanum T, Sinha NK, Cash JN.

1995

Журнал пищевой биохимии

19

51

Икегами Ф, Итагаки С., Муракоши И.

1993

Фитохимия

32

31

Икегами Ф, Муракоши И.

1994

Фитохимия

35

1089

Имаи С., Цуге Н., Томотаке М., Нагатом Й., Савада Х., Нагата Т., Кумагаи Х.

2002

Природа

419

685

Иноуэ К., Нодзи М., Сайто К.

1999

Европейский журнал биохимии

266

220

Киддл Джорджия, Беннетт Р.Н., Хик А.Дж., Уоллсгроув, РМ.

1999

Завод, клетки и окружающая среда

22

433

Кинг Дж. Дж., Брейдин Дж. М., Барк О., Маккаллум Дж. А., Хавей М. Дж..

1998

Теоретическая и прикладная генетика

96

52

Kopsell DE, Randle WM, Eiteman MA.

1999

Журнал Американского общества садоводческих наук

124

1777

Кубек Р., Ким С., МакКеон Д.М., Муса Р.А.

2002

Journal of Natural Products

65

960

Кубец Р., Ким С., Велишек Дж., Муса Р.А.

2002

Фитохимия

60

21

Кубец Р., Муса РА.

2001

Allium s — большой род, содержащий около 700 видов, включая экономически важные овощи и цветущие декоративные растения, а также дикие виды из Европы, Азии и Америки (Fenwick and Hanley, 1985). Их вкус и запах легко узнаваемы в овощах, таких как Allium cepa L. (лук), Allium sativum L. (чеснок), Allium porrum L. (лук-порей), Allium schoenoprasum L.(чеснок) и Allium fistulosum L. (пучковый или валлийский лук). Многие другие представители этого рода выращиваются из-за декоративной ценности своих цветов. Большинство из них растут как двухлетние, давая в конце первого вегетационного периода луковицу для подземного хранения, которая цветет в следующем. Многие дают семена, хотя чеснок обычно не дает. Все они не имеют запаха до тех пор, пока ткань не будет повреждена, после чего все они вырабатывают летучие и реактивные серосодержащие химические вещества, которые вызывают их наиболее известную характеристику.

Природа и происхождение этих ароматических соединений, особенно в луке и чесноке, изучаются с 1940-х годов. Вскоре стало очевидно, что при повреждении растительной ткани сравнительно стабильные предшественники аромата расщепляются с образованием ряда летучих соединений серы, которые претерпевают дальнейшие химические превращения в паровой фазе. Были проведены обширные исследования и обзоры этих газообразных химикатов (Whitaker, 1976; Block, 1992), и они не будут здесь подробно обсуждаться.Вместо этого этот обзор будет сосредоточен на текущих знаниях о биосинтезе предшественников ароматизаторов, сульфоксидов (+) — S -алк (ен) илцистеина (CSO) и их родственников γ-глутамилпептида (γGP). Хотя биосинтетический путь был опубликован (Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989), все еще существует значительная неопределенность в отношении нескольких стадий, взаимосвязи между CSO и γGP и того, следует ли один и тот же путь во всех тканях.

Исследования сосредоточены вокруг роли γGP в пути биосинтеза и происхождения алк (ен) ильных заместителей цистеина.Также был значительный интерес к тому, является ли синтез соединений взаимосвязанным и как он регулируется. О некоторых аспектах, таких как стадия окисления, необходимая для образования сульфоксида, известно очень мало. Имеется некоторая информация о субклеточном расположении биосинтеза аромата и о перемещении предшественников аромата и γGP во время развития растений. После перечисления предшественников аромата, которые были идентифицированы в Allium s, в этом обзоре будет кратко описаны аналогичные соединения, которые были обнаружены в других растениях, предполагая, что этот путь биосинтеза может быть одним из примеров более широко распространенного вторичного метаболического пути.За этим последует набросок доказательств использования γGP в качестве промежуточных продуктов в биосинтезе предшественника вкуса Allium и источника S -алк (ен) ильных групп предшественников. Также будут рассмотрены исследования влияния факторов окружающей среды на биосинтез предшественников аромата. Наконец, будет рассмотрена информация о биосинтезе цистеина, реакциях, в которых участвует глутатион, и источниках алкильных доноров в других растениях, поскольку это основные пути, которые имеют параллели с биосинтезом предшественника ароматизатора Allium .

Биосинтетические пути, предложенные для предшественников ароматизатора Allium , основаны главным образом на химическом анализе и исследованиях радиоактивных индикаторов. Большинство ферментативных активностей, которые потребуются для предложенных этапов биосинтеза, происходят из больших семейств белков, где in vivo тканевая, онтогенетическая и субстратная специфичность большинства членов еще предстоит установить. Применение молекулярно-генетических методов и трансформации растений позволило понять многие аспекты метаболизма растений, и в будущем эти подходы могут открыть новые возможности для улучшения знаний об этой группе вторичных метаболитов, имеющих экономическое, медицинское и кулинарное значение.

Прекурсоры ароматизатора

Четыре нелетучих CSO без запаха (таблица 1) являются предшественниками аромата и запаха Allium s. Это S -метилцистеинсульфоксид (MCSO, метиин; присутствует в большинстве Allium s, некоторые Brassicaceae), S -аллилсульфоксид цистеина (ACSO, аллиин; характерен для чеснока), S — транс — транс -проп-1-енилцистеинсульфоксид (PeCSO, изоаллиин; характерен для лука) и S -сульфоксид-пропилцистеина (PCSO, пропиин; в луке и родственных ему видах).Фермент аллииназа (EC 4.4.1.4) расщепляет эти предшественники с образованием пирувата, аммиака и тиосульфината. Последний подвергается дальнейшим реакциям, так что запах Allium s со временем меняется (Whitaker, 1976). Разложение наиболее широко распространенного из этих предшественников вкуса, MCSO, дает запахи, которые обычно описываются как «капустный» или «свежий лук», в то время как легко различимый запах чеснока происходит аналогичным образом от ACSO. Слезотечение, характерное для лука, вызвано летучим продуктом — пропантиалом S -оксидом (Brodnitz and Pascale, 1971).До недавнего времени считалось, что он образуется спонтанно из тиосульфинатных продуктов реакции аллииназы. Однако он генерируется активностью второго фермента, синтазы слезоточивого фактора, вслед за действием аллииназы на PeCSO, главный предшественник вкуса лука (Imai et al. , 2002). Четвертый предшественник ароматизатора, PCSO, также содержится в луке, а также в нескольких других Allium s. Хотя есть сообщения о появлении других сульфоксидов (+) — S -алк (en) илцистеина в составе Allium s, несколько (например,грамм. 1-оксид 5-метил-1,4-тиазан-3-карбоновой кислоты (циклоаллиин) (Whitaker, 1976), вероятно, образуется в результате химического превращения во время аналитических процедур, а не синтезируется in vivo . Другие, например (+) — S -этилцистеинсульфоксид (Kubec et al. , 2000), являются лишь незначительными составляющими или не обнаруживаются большинством рабочих. Тем не менее, есть несколько сообщений о других сульфоксидах алк (ен) илцистеина в качестве основных предшественников ароматизаторов в декоративных Allium s, таких как S -метилтиометилцистеин-4-оксид (маразмин) в Tulbaghia violacea Harv.(чеснок общества) (Kubec et al. , 2002 a ) и S -бутилсульфоксид цистеина в Allium siculum Ucria. (медовый чеснок) (Кубец и др. , 2002 b ).

Помимо CSO, несколько производных γ-глутамилпептида (γGP) этих ароматических соединений были обнаружены в пределах Allium s (Whitaker, 1976). Выделено более 17 типов (Granroth, 1970), включая γ-глутамил- S -алк (ен) илглутатионы, γ-глутамил- S -алк (ен) илцистеины и γ-глутамил- S . -алк (ен) илцистеинсульфоксиды, все из которых предположительно являются производными глутатиона (γ-глутамилцистеинилглицин).Хотя кажется, что они не вносят непосредственного вклада в аромат, в настоящее время считается, что они являются промежуточными звеньями в биосинтезе, а также могут действовать как запасы азота и серы. Их роль в пути биосинтеза будет обсуждаться ниже.

Растения производят очень большое количество низкомолекулярных соединений, традиционно называемых вторичными метаболитами, выполняющими ключевые функции, включая воспроизводство, защиту, патогенность, устойчивость к стрессу и хранение ресурсов.Биосинтетические пути большинства вторичных метаболитов не описаны подробно, и многие из них, очевидно, сложны (Wittstock and Halkier, 2002). Предположение, что 15-25% генома каждого растения посвящено вторичному метаболизму, является еще одним показателем его важности (Pichersky and Gang, 2000). Таким образом, одна из проблем при изучении вторичного метаболизма состоит в том, чтобы выяснить, какие аспекты синтеза, хранения, функции и деградации конкретного вторичного метаболита разделяют пути, параллельные первичному метаболизму и общие для разных родов, а какие уникальны. к виду или роду.

Один из самых интригующих вопросов об ароматических соединениях — их роль в Allium s. Уровни небелковых производных цистеина и глутатиона составляют 1–5% от сухого веса (Lancaster and Kelly, 1983), что указывает на то, что это основная биосинтетическая активность в растении.Две роли, которые были приписаны, заключаются в защите от вредителей и хищников, особенно в зимующей луковице, и в хранении и транспортировке углерода, азота и серы (Lancaster and Boland, 1990). Было проведено обширное исследование антимикробных свойств экстракта Allium in vitro , рассмотренного Анкри и Мирельманом (1999), но существует меньше примеров in vivo , особенно исследований, посвященных тому, как ароматические соединения передают преимущество луку . с.Устойчивость к болезням не была приоритетом при селекции современных коммерческих сортов лука, поэтому трудно оценить влияние вкусовых соединений (Б. Смит, личное сообщение). В целом, как сообщается, лук с мягким вкусом хуже хранится.

Однако несколько видов насекомых и грибов приобрели специальные взаимодействия с Allium s, где летучие ароматические вещества являются аттрактантами для специализированных питателей и патогенов. Полевые эксперименты на Sclerotium cepivorum Berk.возбудитель белой гнили, одного из наиболее экономически значимых грибковых заболеваний лука и чеснока, показал сильную зависимость от присутствия летучих ароматизаторов для прорастания склероций (Coley-Smith, 1986). Точно так же луковая моль Acrolepiopsis Assectella Zeller и луковая муха Delia antiqua Meigen привлекаются к своим соответствующим растениям-хозяевам летучими ароматическими веществами (Romeis et al. , 2003). В случае белой гнили нет действительно устойчивых сортов лука, и экспериментальное заражение может быть затруднено.Частично эта изменчивость может быть связана с луком, но также с условиями окружающей среды и грибком (Earnshaw et al. , 2000).

Одно интересное наблюдение о роли предшественников аромата было получено в эксперименте Паркина и Томаса (1996) по влиянию элиситоров на уровни предшественников аромата при дифференциации культур каллуса лука. Элиситоры, являющиеся фрагментами патогенов растений, тканями растений или сигнальными молекулами, могут запускать продукцию защитных соединений при их представлении в тканевых культурах (Collin, 2001).В их экспериментах фрагменты клеточной стенки лука и грибов, а также сигнальная молекула салициловой кислоты подавляли выработку предшественников аромата. Это противоположно тому, что можно было бы ожидать, если ароматические соединения участвуют в защите растений.

Биосинтез предшественников ароматизаторов

Исследование биосинтеза ароматических соединений Allium началось с открытия Столлом и Зеебеком (1947) того факта, что ACSO присутствует в тканях чеснока в качестве стабильного источника диаллилтиосульфината (аллицина), основного летучего ароматизатора.Они продемонстрировали, что для превращения ACSO в аллицин требуется фермент аллииназа. Еще два производных сульфоксида цистеина, MCSO и PCSO, были идентифицированы в луке Виртаненом и Матиккала (1959), а четвертый сульфоксид цистеина, PeCSO, вскоре был идентифицирован в луке (Virtanen and Spåre, 1961). Также стало очевидно, что Allium s содержат значительные количества γ-глутамилпроизводных этих соединений (обзор в Whitaker, 1976).

Ланкастер и его коллеги предложили путь (Lancaster and Shaw, 1989; Lancaster et al., 1989; Randle et al. , 1995), требуя γGP в качестве промежуточных продуктов, что стало принято в качестве биосинтетического пути (Block, 1992; Prince et al. , 1997). Путь основан, главным образом, на исследованиях радиоактивной метки и анализе тканей Allium . Он предполагает (рис. 1A), что биосинтез предшественников ароматизаторов в Allium s происходит через S -алк (эн) илилирование цистеина в глутатион с последующей транспептидацией для удаления глицильной группы, окислением до сульфоксида цистеина. и, наконец, удаление глутамильной группы с образованием CSO.Этот путь имеет параллели с деградацией глутатиона (Leustek et al. , 2000), что будет обсуждаться позже. Альтернативный путь биосинтеза (рис. 1B) исключает глутатион в пользу прямого алк (ен) илилирования цистеина или тиоалк (ен) илилирования O- ацетилсерина с последующим окислением до сульфоксида. Это также имеет параллели в производстве нескольких вторичных метаболитов, опосредованных цистеинсинтазой (CS, EC 4.2.99.8, также известной как O -ацетилсеринтиоллиаза) (Ikegami and Murakoshi, 1994).В обоих путях были подробно изучены некоторые из предложенных биосинтетических ферментов из Allium s, и их роль была выведена из других систем. Относительный вклад обоих путей во всех тканях и на протяжении всей истории жизни также неясен, и источник алк (ен) ильных групп еще предстоит выяснить.

Рис. 1.

Два предложенных пути синтеза предшественников ароматизатора Allium , показанные для синтеза сульфоксида метилцистеина.Предполагается, что биосинтез других предшественников протекает аналогично, но с участием другого донора алк (ен) ила. (адаптировано из Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989). Путь A (слева) иллюстрирует участие глутатиона, который метилируется, а затем за счет потери глицина, окисления и, наконец, потери γ-глутамильной группы, превращающейся в метилцистеинсульфоксид. Путь B показывает альтернативный путь через прямое метилирование O -ацетилсерина с образованием метилцистеинсульфоксида.

Рис. 1.

Два предложенных пути синтеза предшественников ароматизатора Allium , показанные для синтеза сульфоксида метилцистеина. Предполагается, что биосинтез других предшественников протекает аналогично, но с участием другого донора алк (ен) ила. (адаптировано из Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989). Путь A (слева) иллюстрирует участие глутатиона, который метилируется, а затем за счет потери глицина, окисления и, наконец, потери γ-глутамильной группы, превращающейся в метилцистеинсульфоксид.Путь B показывает альтернативный путь через прямое метилирование O -ацетилсерина с образованием метилцистеинсульфоксида.

Одна техническая проблема в экспериментах с использованием поврежденных тканей Allium , таких как разрезанные листья или сегменты луковиц, заключается в том, что аллииназа высвобождается и может расщеплять вновь образованные предшественники аромата. Кроме того, пептидазы и γ-глутамилтранспептидазы (EC 2.3.2.2) присутствуют в тканях лука и чеснока (Lancaster and Shaw, 1991; Ceci et al., 1992; Hanum et al. , 1995), предоставляя дополнительные возможности для обмена между биосинтетическими промежуточными продуктами предшественников ароматизаторов. Это может объяснить некоторые расхождения в результатах между разными исследовательскими группами. Некоторые исследования пытались избежать повреждения тканей, отслеживая поступление ³⁵ S-сульфата в корни проростков или прорастающих луковиц. Другая стратегия использует культуру ткани, где тонкая кутикула позволяла вводить потенциальные биосинтетические промежуточные продукты в неповрежденные, но недифференцированные клетки.

Роль γ-глутамилпептидов в биосинтезе предшественника ароматизатора

Lancaster and Shaw (1989) исследовали биосинтетические отношения между γGP и CSO, проследив судьбу короткого импульса ³⁵ S-сульфата в листьях, вырезанных из проростков лука, прорастающих зубчиков чеснока и луковиц декоративного Allium siculum. . Это исследование легло в основу предположения, что γGP являются промежуточными продуктами биосинтеза CSO.Глутатион, γ-глутамилцистеин, γ-глутамилпропенилцистеинсульфоксид, метилглутатион и S -2-карбоксипропилглутатион, наряду с несколькими неидентифицированными соединениями, были помечены в течение первых 15 минут, в то время как для радиоактивной метки потребовалось 6 часов. появляются в ОГО. Хотя на протяжении всего эксперимента в глутатионе было обнаружено некоторое количество ³⁵ S, радиоактивная метка не была обнаружена в γGP после первого дня. В листьях лука MCSO вела себя иначе, чем PeCSO и PCSO, в том смысле, что количество метки оставалось неизменным при измерениях, проведенных через 7 дней, тогда как в PeCSO количество меток увеличилось к этому времени в 8 раз, а в PCSO — в 5 раз. ³⁵ S-меченный S -2-карбоксипропилглутатион был обнаружен в луке и чесноке, но не в A. siculum .

Таким образом, импульс радиоактивной серы был включен сначала в глутатион и γGP, а затем в CSO. Появление меченного радиоактивным изотопом сульфата в глутатионе не является неожиданным, поскольку сульфат ассимилируется в цистеин, и было подсчитано, что одна треть этого количества немедленно направляется в реакции цикла глутатиона. Хотя MCSO присутствует в луке и чесноке, он был основным предшественником вкуса, обнаруженным в A.siculum Ланкастера и Шоу (1989). Присутствие меченого S -2-карбоксипропилглутатиона в луке и чесноке, но не A. siculum , позволяет предположить, что он является промежуточным звеном в биосинтезе аллильной, пропенильной и пропильной групп CSO (рис. 2), в согласии с Гранротом (1970). Аналогичное исследование (Эдвардс и др. , 1994) с использованием интактных наборов прорастающего лука показало, что характер включения отличался в неповрежденных тканях, при этом большая часть радиоактивности происходила в CSO с небольшим указанием на то, что метка была в γGP. до входа во фракцию CSO.Различия, наблюдаемые в ходе этих двух исследований, могут быть вызваны метаболическими различиями между интактными растениями и отделившимися стареющими листьями. Эти эксперименты, тем не менее, предоставили убедительный путь биосинтеза и объяснение взаимосвязи между несколькими соединениями серы, обнаруженными в Allium s. Однако биосинтез в разных тканях и состояниях развития, происхождение алк (ен) ильных групп, а также взаимосвязь между CSO и γGP требуют дальнейшего изучения.

Рис. 2.

Предлагаемый путь биосинтеза аллильных, пропенильных и пропильных групп предшественников ароматизатора Allium (адаптировано из Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989). Показанный путь демонстрирует, как метакрилат может быть преобразован в аллильную, пропильную или пропенильную группу. Другие промежуточные продукты в биосинтезе предшественников ароматизаторов не показаны.

Рис. 2.

Предлагаемый путь биосинтеза аллильных, пропенильных и пропильных групп предшественников ароматизатора Allium (адаптировано из Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989).Показанный путь демонстрирует, как метакрилат может быть преобразован в аллильную, пропильную или пропенильную группу. Другие промежуточные продукты в биосинтезе предшественников ароматизаторов не показаны.

Происхождение заместителей алк (ен) ила

Цистеин, как известно, химически реагирует с метакриловой кислотой с образованием S -2-карбоксипропилцистеина, обеспечивая таким образом путь к алк (ен) ильным группам в ACSO, PeCSO и PCSO. Гранрот (1970) уже показал, что ¹⁴ C-валин дает радиоактивно меченную метакриловую кислоту, которая может реагировать с глутатионом с образованием S -2-карбоксипропилглутатиона. In vivo , метакрилил-КоА является промежуточным звеном катаболизма валина (Zolman et al. , 2001), обеспечивая источник этого материала внутри клетки. На основании этих данных было сделано предположение, что все алк (ен) ильные боковые цепи в CSO (кроме метильной) были образованы из S -2-карбоксипропильной группы посредством декарбоксилирования и восстановления, как показано на рис. 2. В качестве дополнительных доказательств для этого маршрута in vivo , как Granroth (1970), так и Suzuki et al. (1962) идентифицировал включение ¹⁴ C-валина в S -2-карбоксипропилцистеин и S -2-карбоксипропилглутатион.Кроме того, Гранрот (1970) подтвердил, что лук может гидролизовать S -2-карбоксипропилглутатион и что в ткани листьев лука S -2-карбоксипропилцистеин быстро превращается в PeCSO, хотя и без включения радиоактивной метки в S. -2-карбоксипропилглутатион.

Эксперименты для определения способности лука превращать S -2-карбоксипропилцистеин в PeCSO были также проведены Парри и его коллегами. Мечение атома серы и пропильной группы в S -2-карбоксипропилцистеине показало, что луковые растения превращали его в PeCSO без значительных изменений (Parry and Sood, 1989).Эти эксперименты также предоставили информацию об окислительном декарбоксилировании S -2-карбоксипропилцистеина. Тритий в C-2 карбоксипропильной группы оставался в PeCSO, в то время как тритий в C-3 терялся. Это указывает на то, что производное 3-кето- S -2-карбоксипропилцистеина не является промежуточным продуктом в реакции декарбоксилирования. Последующие эксперименты, в которых S -2-карбоксипропилцистеин стереоспецифически тритировали по C-3, доказали, что конфигурация реакции была такой же, как и при декарбоксилировании, связанном с биосинтезом порфирина и терминального алкена у растений (Parry and Lii, 1991).

Есть признаки того, что включение серы в CSO и окисление до сульфоксида осуществляется ферментами с широкой субстратной специфичностью. Биосинтез цистеина путем добавления серы к O -ацетилсерину требует членов семейства цистеинсинтаз, некоторые члены которого, как известно, играют роль во вторичном метаболизме (Ikegami and Murakoshi, 1994). Хотя цистеин может быть алк (ен) илилирован в составе трипептида глутатиона, есть убедительные доказательства того, что это также может происходить во время синтеза одной аминокислоты.Инкубация листьев лука или чеснока с ¹⁴ C-серином и рядом тиолов (включая этантиол, бензолметантиол и 2-тиоэтанол) приводила к синтезу соответствующих замещенных цистеинов с радиоактивной меткой (Granroth, 1970). В целом согласны с этой работой, эксперименты Turnbull et al. (1981) показал, что проникновение ¹⁴ C-серина и ¹⁴ C-цистеина в прорастающие листья лука привело к включению радиоактивности как в MCSO, так и в PeCSO.Добавление серина и либо 2-пропентиола, либо этантиола к культурам корня лука привело к синтезу ACSO и S -этил CSO (Prince et al. , 1997), ни один из которых обычно не синтезируется луком. Однако наблюдение, что доставка меченного радиоактивным изотопом цистеина в ткань лука (Granroth, 1970) всегда приводила к быстрому образованию PeCSO, предполагает, что это происходит непосредственно из цистеина. Если бы перенос тиоалкила на O -ацетилсерин был единственным источником биосинтеза CSO, то маловероятно, что радиоактивные метки попадут в CSO из цистеина.

Доказательства общей природы стадии окисления получены из нескольких исследований, которые демонстрируют окисление экзогенных S -алк (ен) илцистеинов до соответствующего сульфоксида. Гранрот (1970) показал, что S -метилцистеин, S -этилцистеин, S -пропилцистеин и S -пропенилцистеин могут быть окислены до соответствующего сульфоксида тканью лукового листа. Более поздние эксперименты подтверждают этот вывод. Например, ткани лука, чеснока и лука-пучка были способны преобразовывать S -аллилцистеин в ACSO, даже если эти виды не продуцируют ACSO (Ohsumi et al., 1993), с указанием того, что окисление опосредовано стереоспецифическим ферментом. Оксидаза, предложенная Ланкастером и Шоу (1989) для действия на γ-глутамил- S -алк (ен) илцистеины, может, следовательно, также распознавать S -алк (ен) илцистеины.

Контроль биосинтеза предшественников ароматизаторов: биосинтез в культуре тканей

Путь биосинтеза предшественников ароматизаторов в луке и чесноке, по-видимому, не ограничен определенной тканью или типом клеток.Синтез вторичных метаболитов недифференцированными клетками во многих культурах растительных клеток или тканей обычно намного ниже, чем в интактном растении, но изменение условий роста может стимулировать значительное увеличение урожайности (Collin, 2001). Таким образом, исследования с использованием культур тканей лука и чеснока могут дать представление о том, может ли добавление каких-либо предлагаемых биосинтетических промежуточных продуктов стимулировать этапы биосинтеза CSO. Все исследования показывают, что аллииназа присутствует в культурах тканей лука (Davey et al., 1974), но основные предшественники аромата отсутствуют или присутствуют только в небольших количествах в недифференцированной каллусе. Недифференцированные бесцветные каллусы лука и чеснока содержали менее 10% от уровня предшественников аромата в луковицах и почти полностью содержали MCSO (Селби и др. , 1979; Ланкастер и др. , 1988). Следовые количества PeCSO могут быть обнаружены в каллусе лука после инкубации с ¹⁴ C-цистеином или серином (Turnbull et al. , 1981), что указывает на то, что этот путь биосинтеза был активен только в очень ограниченной степени.Имеются сообщения о низких уровнях ACSO и PCSO в недифференцированном каллусе чеснока (Madhavi et al. , 1991), а также о PCSO и PeCSO в каллусе лука-чеснока (Mellouki et al. , 1996), что позволяет предположить, что Allium виды в культуре ткани могут различаться по биосинтетической способности.

Синтез полного спектра предшественников аромата может возобновиться, если каллусам будет позволено повторно дифференцироваться или восстановить способность к фототрофному метаболизму. Как только каллус чеснока снова дифференцировался в зеленые побеги или корни (Lancaster et al., 1988), ткани содержали ACSO, MCSO и PCSO на уровнях, сопоставимых с интактными растениями. Возобновление синтеза предшественника вкуса после повторной дифференцировки каллуса лука на побеги и корни после удаления ауксина 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4, D) было зарегистрировано ранее Turnbull et al. (1981), а ауксин-4-амино-3,5,6-трихлорпиколиновая кислота (пиклорам) индуцировала PeCSO даже на высоких уровнях, которые подавляли явную дифференцировку (Musker et al., 1988).

Добавление доноров S -alk (en) ила или предполагаемых промежуточных продуктов биосинтеза способствует синтезу CSO в тканевых культурах. Очень низкие уровни MCSO и ACSO были обнаружены в побеговых каллюсах чеснока (90 мкМ CSO по сравнению с 6,0 мМ в луковицах) вместе со следовыми количествами S -аллилцистеина и S -метилцистеина (Ohsumi et al. , 1993), но добавление 2-пропентиола к культуральной среде приводило к обнаруживаемым уровням как S, -аллилцистеина, так и ACSO в течение нескольких часов.Недавние эксперименты в нашей лаборатории также продемонстрировали, что как луковые, так и тканевые культуры чеснока способны синтезировать ACSO, если они снабжены 2-пропентиолом или S -аллил-L-цистеином, и PCSO, когда поставляются с пропилтиолом или S — пропил-L-цистеин (J Hughes, неопубликованная работа). Синтез PeCSO может быть аналогичным образом восстановлен до значительных уровней в культуре каллуса лука с помощью S -2-карбоксипропилцистеина или S -пропенилцистеина (Selby et al., 1980). Потенциальные промежуточные продукты, полученные ранее в пути биосинтеза, не имели такого эффекта. Это предполагает, что отсутствие биосинтеза ароматических соединений в культурах ткани лука происходит из-за ингибирования образования S -2-карбоксипропилцистеина.

Таким образом, имеется экспериментальное свидетельство синтеза CSO, протекающего через алк (ен) илилированный свободный цистеин и через S -алк (ен) илилированный глутатион. Вопрос о том, действуют ли оба пути постоянно во всех тканях, еще предстоит решить, но информация о ферментах, необходимых для обоих путей, могла бы помочь в ответе.

Пептидазы и транспептидазы

Связь между γ-глутамилпептидами и алк (ен) илцистеинсульфоксидами, предложенная Ланкастером и соавторами (Lancaster and Shaw, 1989; Lancaster et al. , 1989; Randle et al. , 1995), где первые являются биосинтетическими предшественниками последнего, требуется активность ферментов по удалению глициловых и γ-глутамильных остатков из возникающего алк (ен) илсульфоксида. γ-глутамилтранспептидаза катализирует перенос γ-глутамильной группы от γ-глутамилпептидов либо к аминокислотам, либо к другим пептидам.Этот фермент может также действовать как γ-глутамилпептидаза, требуя только воды в качестве акцептора. У млекопитающих и микроорганизмов он участвует в «γ-глутамиловом цикле» (рис. 3), который разрушает глутатион и участвует в транспорте цистеина (Noctor et al. , 2002). Обе эти активности были обнаружены в водных экстрактах гвоздики и листьев проросшего сорта чеснока Red (Ceci et al. , 1992). Активность ферментов была выше в быстрорастущих листьях. Активность гамма-глутамилпептидазы была зафиксирована в листьях лука-чеснока и снизилась до 5% от этого уровня в клеточных культурах (Mellouki et al., 1996). Добавление экзогенной пептидазы увеличивало выход аллииназной реакции из культур клеток лука-чеснока, предполагая, что недостаток γ-глутамилтранспептидазы также может быть причиной низких уровней предшественников аромата в культуре тканей.

Рис. 3.

Предлагаемые пути деградации глутатиона у растений и животных. (Адаптировано из Leustek et al. , 2000; Noctor et al. , 1998.) Путь A (слева) указывает на γ-глутамиловый цикл у животных.Путь B (справа) указывает на второй путь, который существует по крайней мере в некоторых растениях.

Рис. 3.

Предлагаемые пути деградации глутатиона у растений и животных. (Адаптировано из Leustek et al. , 2000; Noctor et al. , 1998.) Путь A (слева) указывает на γ-глутамиловый цикл у животных. Путь B (справа) указывает на второй путь, который существует по крайней мере в некоторых растениях.

Активность γ-глутамилпептидазы была обнаружена в листьях, корнях и луковицах растущего лука, но не в спящих луковицах разновидности Саутпорт Уайт Глоб (Lancaster and Shaw, 1991).Однако он был обнаружен в хранящихся луковицах лука сорта Спартан Баннер, когда они хранились при 20 ° C в течение 8 месяцев. Активность постепенно увеличивалась с четвертого месяца в магазине (Hanum et al. , 1995). Измерение сульфоксида γ-глутамилпропенилцистеина и PeCSO в луковицах семи сортов лука при хранении в прохладном месте в течение 4 месяцев показало постепенное снижение уровней сульфоксида γ-глутамилпропенилцистеина и повышение уровней PeCSO (Kopsell et al. , 1999).Исследование луковиц показало, что некоторые из них оставались бездействующими во время хранения, в то время как другие сорта выходили из состояния покоя после первого месяца. Очевидно, что сорта лука различаются по характеристикам хранения, и это может объяснить разные результаты по активности γ-глутамилтранспептидазы, обнаруженные в этих исследованиях.

В прорастающих луковицах лука это связано с гидролизом и ремобилизацией γGP. Γ-глутамилтранспептидаза была частично очищена из лука (Lancaster and Shaw, 1994), который проявлял как пептидазную активность, которая не зависела от pH, так и активность транспептидазы, которая существенно повышалась при pH выше 8.0. Он показал значения K _m между 0,4 мМ и 2,0 мМ для нескольких производных γ-глутамила и значение K _m для глутатиона 5 мМ. Его субстраты включали γ-глутамилметилцистеин, γ-глутамилпропенилцистеин, 2-карбоксиглутатион и сульфоксид γ-глутамилпропенилцистеина, причем для последних двух значений K _m были ниже расчетных клеточных концентраций (Lancaster and Shaw , 1994). Если гидролиз γ-глутамиловой части сульфоксидов γ-глутамилалк (ен) илцистеина требовался во время синтеза CSO в этих тканях, этот фермент мог быть задействован, и эксперименты in vitro показали, что он обладает широкой субстратной специфичностью.Имеются также данные о другом пути деградации глутатиона у некоторых растений (рис. 3B), который начинается с удаления остатка глицина из глутатиона, а не глутамильной группы (Leustek et al. , 2000).

Контроль биосинтеза предшественников ароматизаторов: влияние подачи и хранения серы и азота

Очевидно, что для биосинтеза ароматических соединений требуется значительное количество серы. При коммерческом производстве лука обычно считается, что на остроту влияет сера, при этом более высокая доступность серы, как правило, приводит к большей интенсивности вкуса.Существует коммерческий интерес к выращиванию мягкого лука, и это обычно предполагает использование соответствующих сортов лука в среде с низким содержанием серы (Randle et al. , 1995). Исследования влияния этих режимов роста на вкус дают некоторую информацию о биосинтезе аромата. Влияние на накопление серы и уровни ароматических соединений в луке при изменении среды роста предполагает, что MCSO ведет себя иначе, чем PeCSO.

Хотя PeCSO является основным CSO в луке, синтез MCSO можно улучшить, изменив условия выращивания за пределами диапазонов, обычно встречающихся в сельском хозяйстве.К ним относятся низкий уровень серы (S) и высокий уровень азота (N). Исследование 16 сортов лука короткого дня, выращенных в искусственной почвенной среде с двумя уровнями содержания серы (в виде сульфата, 2,0 мМ и 0,05 мМ), показало, что, хотя луковицы, выращенные с более высоким уровнем серы, содержали больше предшественников аромата (Randle and Bussard, 1993), было мало корреляции между уровнями серы в почве и предшественниками ароматизаторов (измеренными как ферментативно генерируемый пируват). Однако более позднее исследование только трех сортов лука (Рио-Гранде, Саванна Свит и Саутпорт Уайт Глоб) дало более подробную картину.Эти луковицы выращивали на песке, поддерживающем пять уровней сульфата (Randle et al. , 1995). При самом низком уровне сульфата (0,05 мМ) все сорта демонстрировали симптомы дефицита серы, но почти 95% общей серы в луковице можно было отнести к MCSO, PCSO и PeCSO и сульфоксиду γ-глутамилпропенилцистеина, что указывает на биосинтез предшественника вкуса. был сильным поглотителем серы даже при недостатке серы. При наивысшем уровне использованного сульфата (1,55 мМ) менее 40% серы в луковице могло быть отнесено к этим соединениям и, вместо этого, должно было присутствовать в компонентах пути биосинтеза ароматизатора, которые не были измерены, или в других органических соединениях серы. .

В более позднем исследовании было обнаружено значительное количество сульфата в луковицах этих трех сортов, которое увеличивалось по мере увеличения уровня сульфата в искусственной питательной среде (Randle et al. , 1999). Общее количество серы в луковицах всех трех сортов было одинаковым на каждом уровне сульфата в среде и увеличивалось по мере увеличения уровней. Уровень CSO (измеренный как ферментативно генерируемый пируват) также увеличивался в ответ на увеличение содержания сульфата в среде для выращивания, но уровни отдельных CSO были разными для трех сортов.MCSO преобладала при самых низких уровнях сульфата во всех трех сортах и ​​оставалась аналогичной или уменьшалась по мере увеличения содержания сульфата в среде. Выше 0,425 мМ уровень PeCSO повышался до уровня MCSO или превышал его. Саутпорт Уайт Глоуб имел более низкий уровень PeCSO, чем два других сорта, на который не повлияло увеличение содержания сульфата. Уровни PeCSO в Рио-Гранде были выше, но также не подвержены влиянию сульфатов в окружающей среде. Однако уровни в Savannah Sweet неуклонно снижались по мере увеличения содержания сульфата.McCallum et al. (2002) наблюдали изменения в уровнях транскриптов нескольких генов, необходимых для поглощения и ассимиляции сульфатов (APS-редуктаза, АТФ-сульфурилаза, высокоаффинный переносчик сульфата и сульфитредуктаза) в ответ на временное или долгосрочное лишение серы сортов лука Canterbury Longkeeper и Houston Grano, указывающие на то, что регулирование этих начальных стадий ассимиляции серы также лежит в основе различий во вкусе лука.

Для выращивания перезимованного лука с мягким вкусом на супесчаной почве в регионе Видалия, США, применение удобрений, содержащих S , не рекомендуется с весны, так что лук будет испытывать среду с пониженным содержанием серы. .Сульфат применяется зимой, чтобы обеспечить хороший рост корней и листьев. При исследовании графика вывода сульфата сорт Sweet Vidalia выращивали в искусственной среде, где начальный уровень 1 мМ сульфата был снижен до 0,05 мМ для шести групп растений с последовательными двухнедельными интервалами (Randle et al. ). , 2002). Анализ содержания серы в листьях и луковицах при сборе урожая показал, что было больше серы в луковицах или листьях, где более высокий уровень серы сохранялся до ближайшего времени сбора урожая.Уровни CSO (измеренные как ферментативно генерируемый пируват) также были выше в луковицах, выдерживаемых при концентрации 1 мМ сульфата дольше. Однако анализ отдельных CSO и сульфоксида γ-глутамилпропенилцистеина показал, что, хотя низкие уровни PCSO не зависели от снижения содержания сульфата, уровни γ-глутамилпропенилцистеинсульфоксида и PeCSO увеличивались в луковицах растений, поддерживаемых на более высоком уровне. сульфата дольше. Уровни MCSO были постоянно самыми высокими, но снижались, когда вывод сульфата откладывался.Различное поведение трех предшественников аромата было очень очевидным.

Метаболизм серы тесно связан с метаболизмом азота через выработку аминокислоты цистеина как первого органического соединения серы при ассимиляции серы. Таким образом, подача азота может влиять на поглощение серы и образование CSO. Интересно, что N, по-видимому, не влияет на уровень неорганической S (измеряемой в виде сульфата) в луковицах, а вместо этого изменяет уровни некоторых ассимилятов серы.Когда сорт лука Granex 33 был выращен гидропонно с 250 мг на литр ^-1 S и 20-140 мг на литр ^-1 N (из нитрата аммония), хотя уровень неорганической серы в луковицах не был затронут, органическая сера в луковицах оставалась неизменной. луковиц увеличивалось, когда количество серы в гидропонной среде увеличивалось примерно до 80 мг / л ^-1 N, но впоследствии уменьшалось (Coolong and Randle, 2003 a ). Анализ CSO и γGP показал, что основной эффект был на сульфоксид γ-глутамилпропенилцистеина, где уровни увеличивались примерно в 10 раз до 80 мг / л ^-1 N, а затем существенно снижались.Уровни PCSO практически не пострадали, но MCSO постоянно увеличивалась по мере увеличения внешнего уровня азота. PeCSO также находился под влиянием, немного увеличиваясь, когда уровень азота в гидропонной среде повышался до 80 мг / л ^-1 N, но затем немного снижался. Как следствие, PeCSO вносил основную долю предшественников ароматизатора при более низких уровнях азота (20–56 мг на л ^-1 N), а MCSO был основным компонентом выше 80 мг на литр ^-1 Н. Разница в поведении между Интересны три предшественника аромата, так же как и тот факт, что действительно основное влияние было на уровни γGP, а не CSO.

В дополнение к этому исследованию уровень серы и азота, доступный для сорта Granex 33 по мере его созревания в гидропонной культуре, варьировался (5, 45 и 125 мг л ^-1 S в виде сульфата; 10, 50, 90 и 130 мг / л ^-1 N нитрата аммония). Самый низкий уровень азота привел к появлению симптомов дефицита, включая пожелтение листьев и небольших луковиц, содержащих меньшее количество N, S, CSO и γGP, чем после всех других обработок (Coolong and Randle, 2003 b ).При самом низком уровне N (10 мг / л ^-1 ) уровни MCSO, PCSO и γGP в луковицах оставались низкими и неизменными, независимо от поступления серы. Единственным исключением были уровни PeCSO. Это было выше в среде с дефицитом азота при самом низком уровне серы, чем при более адекватной подаче азота. Уровни MCSO были постоянно выше, чем у PeCSO. Это указывает на то, что поступление азота, а не серы, оказывает большее влияние на уровни MCSO. Различные эффекты поставки S на PeCSO и γGP предполагают, что их синтез находится под разным контролем.

Еще одно исследование, которое показало различное поведение MCSO и PeCSO, проводилось во время хранения луковиц лука более 4 месяцев. За это время уровни PeCSO увеличились во всех шести сортах лука, в то время как уровни MCSO остались практически такими же или снизились (Kopsell et al. , 1999).

Тканевое и субклеточное расположение

Имеется ограниченная информация о том, где синтезируются предшественники ароматизаторов, и это обобщено для местоположений внутри ячейки на рис.4. После выделения хлоропластов, митохондрий и цитоплазмы из эпидермиса листьев прорастающих луковиц лука глутатион был идентифицирован в хлоропластах и ​​цитоплазме, в то время как CSO и γGP располагались только в цитоплазме, а γ-глутамилцистеин — в хлоропластах ( Lancaster и др. , 1989). Также было идентифицировано расположение нескольких активностей ферментов, необходимых для биосинтеза. Один из ферментов, необходимых для биосинтеза глутатиона, γ-глутамилцистеинсинтетаза, находится в хлоропластах, тогда как γ-глутамилтранспептидаза находится в цитоплазме, хотя небольшая часть может быть связана с пероксисомами.

Рис. 4.

Субклеточное расположение промежуточных продуктов биосинтеза, предшественников ароматизаторов и аллииназы в Allium s. Местонахождение основано на данных по луку и чесноку, а также на местонахождении подобных ферментов в других растениях. У лука аллииназа присутствует в вакуоли всех клеток. В чесноке аллииназа присутствует только в вакуоли клеток оболочки пучка. Не в масштабе.

Рис. 4.

Субклеточное расположение промежуточных продуктов биосинтеза, предшественников ароматизаторов и аллииназы в Allium s.Местонахождение основано на данных по луку и чесноку, а также на местонахождении подобных ферментов в других растениях. У лука аллииназа присутствует в вакуоли всех клеток. В чесноке аллииназа присутствует только в вакуоли клеток оболочки пучка. Не в масштабе.

Зрелые клетки луковицы луковицы большие и тонкостенные с тонким периферическим слоем цитоплазмы, выстилающей внутреннюю часть стенки. Большая центральная вакуоль занимает большую часть объема клетки. Электронная микроскопия показала наличие мелких пузырьков как в цитоплазме, так и в центральной вакуоли (Turnbull et al., 1981). Выделение вакуолей из чешуек внутренней луковицы показало, что литический фермент аллииназа изолирован внутри вакуоли, в то время как предшественники аромата находятся в цитоплазме (Lancaster and Collin, 1981). Дальнейшее исследование (Lancaster et al. , 1989) субклеточной локализации в луке подтвердило эти результаты. Прорастающие листья лука инкубировали с ³⁵ S-сульфатом в течение 1 дня для мечения предшественников ароматизатора. CSO были обнаружены в цитоплазматической фракции.Свидетельством того, что аллииназа была изолирована в вакуоли, был сильный запах лука, который обнаруживался при лизировании протопластов и вакуолей.

В отличие от лука, аллииназа в чесноке ограничена определенными типами клеток. Запасной орган лука состоит из чешуек, образовавшихся от набухших оснований листьев, тогда как у чеснока он образован от набухших боковых почек. Зубчики чеснока содержат сильно вакуолизированные клетки паренхимы как запасной мезофилл, перемежающийся с сосудистыми пучками. Когда свежие срезы гвоздики рассматривали в синем свете (Ellmore and Feldberg, 1994), наблюдалась сильная желто-зеленая автофлуоресценция от клеток оболочки пучка, а не от клеток любого другого типа.Эти клетки образовывали слой толщиной от одной до четырех клеток вокруг сосудистых пучков. Флуоресценцию приписывают кофактору пиридоксаль-5′-фосфата, присутствующему в аллииназе. Это было подтверждено окрашиванием срезов зубчиков чеснока на активность аллииназы, где клетки оболочки пучка стали плотно окрашены, с указанием того, что пятно было в вакуоли (Ellmore and Feldberg, 1994). Поликлональные антитела к аллииназе также интенсивно окрашивали внутреннюю часть клеток оболочки пучка. Окрашивание соседнего запасающего мезофилла, хотя и присутствовало, было намного слабее, и не было окрашивания клеток мезофилла, более удаленных от сосудистых пучков.Это клеточно-специфическое расположение аллииназы в чесноке отличается от ситуации в луке, где данные свидетельствуют о том, что она присутствует в вакуолях всех клеток луковиц и листьев.

Луковицы лука луковицы появляются в течение 4–6 недель, когда растение увеличивается в весе в 3–4 раза. Ланкастер и его коллеги проследили изменения в предшественниках вкусовых добавок, которые произошли во время этого процесса (Lancaster et al. , 1986). Белые нефотосинтетические основания листьев набухают, образуя луковицу в виде ряда концентрических чешуек.Новые чешуйки луковицы быстро расширяются в центре развивающейся луковицы, тогда как более старые стареют так же быстро, образуя внешние бумажные защитные слои. Анализ предшественников аромата в листьях и чешуях луковиц развивающихся луковиц показал, что предшественники аромата перемещались от листовой пластинки к ее основанию по мере развития чешуек луковицы (Lancaster et al. , 1986). Листовые пластинки содержали большое количество всех трех предшественников аромата до образования луковиц, но по мере развития луковиц уровни упали на 90%, и только PCSO оставалось в значительных количествах.По мере созревания луковицы предшественники аромата были потеряны из внешних стареющих чешуек, и PCSO увеличилось в центральных чешуях, хотя уровни MCSO и PeCSO упали. Самые внутренние чешуйки луковицы не имели прикрепленных листовых пластинок, но содержали предшественники аромата. Анализ базальной пластинки луковицы обнаружил значительное количество предшественников аромата, что указывает на то, что это может быть путь движения между чешуей. При исследовании трех различных сортов лука (Hysam, Durco и Grano de Oro) Bacon et al. (1999) определила, что PeCSO был основным предшественником ароматизатора, и его уровень повышался во внутренних мясистых слоях, а также в верхней и нижней части луковиц после 6 месяцев хранения при 0–0,5 ° C. Уровни предшественников аромата были выше во внутренних мясистых слоях луковиц, а также в верхнем и нижнем сантиметрах луковиц, чем в двух внешних мясистых слоях луковиц.

Ферменты, которые могут участвовать в биосинтезе предшественника ароматизатора

Вторичные метаболические пути могут осуществляться через более чем один компартмент или тип клеток.Это может быть необходимо для регуляции или функции метаболита, но также может быть результатом эволюционного происхождения ферментов (Pichersky and Gang, 2000). Новый фермент возникнет как разновидность существующего фермента, который использовал аналогичный субстрат и катализировал образование аналогичного продукта. Некоторые из ферментов, которые были предложены для катализирования стадий биосинтеза ароматических соединений в Allium s, являются членами больших семейств, которые выполняют очень разнообразные функции. При вторичном метаболизме единственный способ однозначно определить функцию продукта гена в настоящее время — продемонстрировать его ферментативную активность.Было проведено очень мало исследований ферментов из Allium s, которые были бы необходимы для синтеза предшественников ароматизаторов. Следовательно, будет представлена ​​информация о метаболизме глутатиона и цистеина и C-S-лиазах с указанием аспектов, которые могут иметь отношение к ролям в биосинтезе предшественника ароматизатора Allium .

Глутатион и глутатион-

Прекурсоры аромата Allium s — одно из немногих мест, где конъюгаты глутатиона, как полагают, играют роль в эндогенном метаболизме растений.Обе стадии, предложенные для конъюгации глутатиона с метильными, 2-карбоксипропильными или метакрилатными группами, и последующая деградация глутатионовой части с образованием CSO имеют параллели в метаболизме глутатиона, который изучался на других растениях. Глутатион синтезируется как в цитозоле, так и в хлоропласте, и это согласуется с доступностью цистеина (Noctor et al. , 2002). Он не продуцируется с одинаковой скоростью всеми тканями и типами клеток растений. Например, трихомы на стеблях и листьях некоторых экотипов Arabidopsis thaliana демонстрируют гораздо более высокую экспрессию ферментов, участвующих в синтезе цистеина и глутатиона, и имеют более высокие уровни глутатиона, чем окружающие клетки (Gutierrez-Alcala et al., 2000). Если для синтеза CSO требуется глутатион, контроль синтеза глутатиона в Allium s вполне может отражать потребность в гораздо более высоком потоке, чем в других растениях.

Глутатион- S -трансферазная активность в Allium s детально не изучена. Он был обнаружен в эпидермальной ткани луковиц лука. Он присутствовал как в цитозольной, так и в микросомальной фракциях, и анализы с серией субстратов показали, что ферменты в каждом компартменте имели различную специфичность (Schröder and Stampfl, 1999).Когда конъюгация с флуоресцентным субстратом монохлорбиманом наблюдалась под микроскопом в эпидермальных полосках, флуоресценция была очевидна в цитоплазме и ядре, за которой следовала яркая и увеличивающаяся флуоресценция в вакуоли, когда конъюгат транспортировался туда.

Глутатион- S -трансферазы представляют собой большое и древнее суперсемейство ферментов, где N-концевой сайт связывания глутатиона лучше консервативен, чем C-концевой сайт связывания совместного субстрата. Экспрессия специфических глутатион- S -трансфераз заметно варьирует во время развития растений, деления клеток и старения (Marrs, 1996).Роль глутатион- S -трансфераз в детоксикации ксенобиотиков, таких как гербициды, широко изучалась (обзор Marrs, 1996; Coleman et al. , 1997). Они действуют совместно с другими ферментами, выводя токсины из ксенобиотиков за счет конъюгации с глутатионом для повышения растворимости в воде. Это опосредуется глутатион- S -трансферазами в цитозоле, и затем конъюгат транспортируется в вакуоль или апопласт с помощью транспортеров, расположенных внутри тонопласта или плазматической мембраны.Вакуолярная карбоксипептидаза может отщеплять глицин от конъюгатов глутатион- S , а дипептидаза может удалять глутамильную группу, оставляя цистеиновый конъюгат (цитируется в Coleman et al. , 1997). Отток конъюгатов цистеина из вакуоли сопровождается дальнейшим метаболизмом C-S-лиазами в цитозоле. Метаболиты, продуцируемые этим процессом, могут экспортироваться в апопласт и связываться с лигнином и целлюлозой (Coleman et al. , 1997).

Биосинтез предшественников ароматизатора Allium может быть примером использования этой системы для синтеза вторичных метаболитов, хотя, по-видимому, задействованы разные клеточные компартменты.Как показано на рис. 4, аллииназа изолирована в вакуоли, а не в цитоплазме, а CSO находятся в цитоплазме (Lancaster and Collin, 1981) или в небольших цитоплазматических пузырьках (Edwards et al. , 1994). Хотя сульфоксиды γ-глутамилалк (ен) илцистеина не являются субстратами для аллииназы, если они обрабатываются в вакуоли, им может потребоваться защита от аллииназы перед экспортом в цитоплазму. В этом контексте наблюдение, что аллииназа образует стабильный комплекс с лектином в чесноке (Rabinkov et al., 1995; Смец и др. , 1997). Эти два являются основными белками зубчиков чеснока, и хотя нет никаких доказательств того, что этот комплекс существует in vivo , он может обеспечить средства для дальнейшего отделения аллииназы от ее субстрата.

Синтез цистеина

Требование высоких уровней продукции цистеина в Allium s предполагает, что регуляция биосинтеза цистеина может отличаться от других растений.Кроме того, исследования включения серина и тиолов в Allium s (Granroth, 1970; Ohsumi et al. , 1993; Prince et al. , 1997) показывают, что биосинтез цистеина может обеспечить путь для синтеза некоторых S -алк (ен) ил цистеинов.

Заключительная стадия синтеза цистеина катализируется двумя последовательными ферментами, серинацетилтрансферазой (SAT (EC 2.3.1.30) и цистеинсинтазой (Leustek et al. , 2000). Это стадия, на которой неорганическая сера включается в первое органическое соединение серы в клетке, а также точка, в которой пути ассимиляции углерода и азота встречаются с ассимиляцией серы.После добавления O -ацетильной группы к серину с помощью SAT образуется аминоакрилатный аддукт O -ацетилсерина, связанный с пиридоксаль-5′-фосфатным кофактором CS. Он реагирует со вторым субстратом, сульфидом, с образованием цистеина, который высвобождается (Warrilow and Hawkesford, 2002). Каталитический механизм CS с промежуточным соединением, связанным с ферментом, обеспечивает возможности для развития активного центра для размещения различных заместителей.

Растения содержат семейства SAT и CS с цитозольными, хлоропластическими и митохондриальными изоформами (Inoue et al., 1999). Причина множественных форм и их наличие в отдельных органеллах неясна. С точки зрения синтеза предшественников ароматизатора Allium наиболее интересным аспектом является то, что некоторые CS обладают более широкой субстратной специфичностью, чем один сульфид. Фермент принадлежит к семейству β-замещенных аланинсинтаз, и существует несколько примеров активности CS с вторичной, а не первичной метаболической ролью (Ikegami and Murakoshi, 1994). Вид Mimosa L.и Leucaena Benth. накапливают мимозин, а представители семейства тыквенных, такие как арбуз ( Citrullus vulgaris Schrad.), содержат β-пиразол-1-илаланин. Оба этих вторичных метаболита образуются CS путем связывания пиразола или 3,4-дигидроксипиридина с O -ацетилсерином. Другие гетероциклические β-замещенные аланины были идентифицированы в составе других видов растений, помимо метаболитов регуляторов роста зеатина и 6-бензиламинопурина, а также ксенобиотиков, таких как триазольные гербициды (Ikegami and Murakoshi, 1994), которые все могут быть синтезированы путем конденсации соответствующее N -гетероциклическое соединение с O -ацетилсерином, опосредованное CS из видов растений, где вторичный метаболит встречается в природе.

В условиях анализа in vitro CS может использовать множество других соединений в качестве акцептора для аланильной части из O -ацетилсерина. Когда представлены подходящие субстраты, CS, очищенные от Leucaena leucocephala Lam. (De Wit), Pisum sativum L., Citrullus vulgaris , Spinacia oleracea , Lathyrus latifolius L., Lathyrus sativus L. и Allium tuberosum Rottl. ex Spreng.все были способны синтезировать S -метилцистеин, S -аллилцистеин и S -карбоксиметилцистеин со скоростью от 1% до 72% от таковой для синтеза цистеина (Ikegami and Murakoshi, 1994). С другими субстратами ферменты CS этих видов образовывали другие небелковые β-замещенные вторичные метаболиты аланина in vitro (Ikegami and Murakoshi, 1994).

SAT и CS из A. tuberosum были подробно изучены (Ikegami et al., 1993; Урано и др. , 2000). Два CS были очищены из листьев, которые не показали ингибирования O -ацетилсерином в концентрациях до 25 мМ. Оба они были способны синтезировать S -замещенные цистеины, а также β-цианоаланин, хотя и со скоростью менее 10% от цистеина в тех же условиях (Ikegami et al. , 1993). Субстраты, используемые этими ферментами, очень похожи на субстраты, используемые ферментом Spinacia oleracea .Измерение чувствительности SAT A. tuberosum к цистеину показало, что концентрация для 50% ингибирования составляла 48,7 мкМ, что было промежуточным между значениями, обычно получаемыми для чувствительных к обратной связи (<5 мкМ) и нечувствительных (> 100 мкМ) ферментов (Urano и др. , 2000). Уровни цистеина в A. tuberosum , около 45 нмоль на г ^-1 сырого веса, были оценены в 5–6 раз выше, чем в Nicotiana tabacum L. или Arabidopsis thaliana .Интересно, что уровни окисленного и восстановленного глутатиона у трех растений были сопоставимы. Более высокий уровень цистеина в A. tuberosum можно объяснить низкой чувствительностью SAT к ингибированию цистеина или другими факторами в обороте цистеина, необходимыми для удовлетворения спроса на биосинтез предшественника ароматизатора. Работа в нашей лаборатории показала, что чеснок имеет несколько CS, которые различаются по экспрессии в тканях и способности синтезировать S -аллил цистеин (A Tregova, J Hughes and J Milne, неопубликованная работа).

Продукция O -ацетилсерина с помощью SAT из Citrullus vulgaris (арбуз) проявляет ингибирование цистеином на физиологических уровнях (50% ингибирование при 2,9 мкМ), но не подвергается влиянию вторичного метаболита β-пиразол-1- илаланин даже в концентрации 1 мМ (Saito et al. , 1995), что позволяет предположить, что фермент ведет себя по-разному в регулировании поставки O -ацетилсерина для выполнения своих первичных и вторичных метаболических ролей. Синтез цистеина можно жестко регулировать, тогда как синтез β-пиразол-1-илаланина на этой стадии не контролируется.Если CS участвует в биосинтезе предшественников ароматизатора Allium , возможно, что подобная регуляторная система может быть задействована.

Последний пример цистеина в синтезе соединений, аналогичных предшественникам ароматизатора Allium , происходит из механизма толерантности к селену, обнаруженного у некоторых растений. Сера и селен химически подобны, и, таким образом, селен может быть включен в соединения, которые должны содержать серу, что приводит к проблемам токсичности.Анализ селенсодержащих летучих веществ из лука, чеснока, A. tuberosum и A. ampeloprasum L. показал, что Se-метильные соединения преобладают, несмотря на обилие других соединений S -алк (ен) ила в растения (Cai et al. , 1994). В некоторых ситуациях происходит различие между этими двумя элементами, и один из них заключается в синтезе Se-метил селеноцистеина в механизме толерантности растений Fabaceae, которые накапливают высокие уровни селена (Ellis and Salt, 2003).Растения синтезируют Se-метил селеноцистеин, γ-глутамил-Se-метил селеноцистеин и другие производные селена небелковых аминокислот, которые можно рассматривать как селеновые аналоги S -алк (ен) илцистеина и γ-глутамил- алк (ен) ил цистеиновые пептиды. Идентификация тиол / селенолметилтрансферазы из Astragalus bisulcatus (Neuhierl et al. , 1999) прояснила биосинтез этих метаболитов. Экспрессия фермента в Escherichia coli показала, что его субстратами были S -метилметионин и селеноцистеин, а активность с цистеином была близка к пределам обнаружения анализа.Хотя этот фермент из A. bisulcatus не может синтезировать S -метилцистеин, синтез этих метилированных и γ-глутамилированных аминокислот представляет собой интересную параллель с биосинтезом предшественника ароматизатора в Allium s.

Аллииназа и лиазы C-S

C-S-лиазы в растениях участвуют в первичном и вторичном метаболизме, расщепляя связи между атомами серы и углерода, и являются частью более крупного семейства аминотрансфераз.Члены включают аллииназу, а также цистатионин и цистинлиазы, цистеин-десульфидразу и ферменты, участвующие в детоксикации ксенобиотиков после конъюгации с глутатионом, а также, вероятно, другие, участвующие в биосинтезе глюкозинолатов и цианогенных глюкозидов (Kiddle et al. , 1999). Есть признаки того, что луковая аллииназа предпочтительно гидролизует PeCSO, а не MCSO или PCSO, поэтому PeCSO вносит больший вклад в аромат лука, чем два других предшественника (Nock and Mazelis, 1987; Coolong and Randle, 2003 b ).

Трехмерная кристаллическая структура аллииназы была решена с разрешением 1,5 Å в 2002 г. (Kuettner et al. , 2002). Это показало, что каждый 448 аминокислотный мономер фермента содержит три домена. Центральный и С-концевой домены имеют складчатую структуру, типичную для других C-S лиаз и аминотрансфераз. Центральный домен типичен для пиридоксаль-5′-фосфатзависимых ферментов класса 1. N-концевой домен отличает структуру аллииназы от других C-S лиаз и аминотрансфераз благодаря наличию EGF-подобного домена.Этот тип домена часто взаимодействует с другими белками и обычно содержит три дисульфидных мостика, образованных между остатками цистеина. Они редко встречаются в растительных белках, и аллииназа является первой, где EGF-подобный домен сливается с каталитическим доменом, а не как внеклеточная часть мембраносвязанного или секретируемого белка. Однако вакуолярное расположение аллииназы требует процесса транспорта после синтеза, который может обеспечивать функцию этого домена.

Источники алк (ен) ильных групп в прекурсорах ароматизатора

Хотя очевидно, что ряд тиолов может быть источником S -алк (en) ильных групп для ферментов CS in vitro (Ikegami and Murakoshi, 1994), в срезах ткани или в тканевой культуре (Granroth, 1970; Prince et al., 1997), неизвестно, играют ли они эту роль in vivo. Растительные ацил-активирующие ферменты особенно плохо охарактеризованы (Shockey et al. , 2003), и даже некоторые из этих параллельно хорошо охарактеризованных ферментов млекопитающих, по-видимому, играют разные роли. Arabidopsis thaliana , по-видимому, имеет 63 организма, что больше, чем у любого другого полностью секвенированного организма на сегодняшний день, предлагая большие возможности для опосредования стадий вторичного метаболизма, с возможностью того, что некоторые или их гомологи в Allium s могут выполнять неуловимый перенос алк (ен) ила в биосинтезе предшественника ароматизатора Allium (Shockey et al., 2003). Селеноцистеинметилтрансфераза из Astragalus bisulcatus , которая использует S -метилметионин для метилирования селеноцистеина, а не цистеина (Neuhierl et al. , 1999), является одним из примеров специализированной активности.

Метакрилат, предложенный в качестве предшественника аллильной, пропильной и пропенильной групп (Granroth, 1970; Lancaster and Shaw, 1989), встречается внутри клетки во время распада валина жирной кислоты с разветвленной цепью, вероятно, внутри пероксисомы растения.Реакционноспособный интермедиат метакрилил-КоА временно образуется во время этого процесса и может реагировать с нуклеофилами, такими как свободные тиолы (Zolman et al. , 2001). Хотя было выявлено заболевание человека, вызванное накоплением этого реактивного промежуточного продукта в митохондрии, у Arabidopsis thaliana тот же самый дефект вызывает устойчивость к ауксину и дефекты β-окисления в пероксисоме. Результат может быть другим в пероксисомах, где метакрилил-КоА синтезируется в регулируемом процессе с обильным поступлением тиолов из цистеина или глутатиона.

Еще один пример возможного происхождения аллильной группы, характерной для чеснока, — это более 120 вторичных метаболитов глюкозинолатов, обнаруженных в Brassicaceae, Capparaceae и Caricaceae (Fahey et al. , 2001). Биосинтез основной структуры глюкозинолата включает конъюгацию модифицированной аминокислоты с донором серы, предположительно цистеином, с последующим расщеплением, вероятно, CS-лиазой, с получением серосодержащего продукта, который впоследствии глюкозилируется и сульфатируется (Wittstock and Halkier , 2002).Может происходить очень обширная модификация аминокислоты, включая создание аллильной группы. Между окислением модифицированной аминокислоты цитохромом P ₄₅₀ с образованием альдоксима и образованием тиогидроксимовой кислоты перед гликозилированием не было идентифицировано ни промежуточных продуктов, ни ферментов. Хотя активность C-S-лиазы, полученная из листьев Brassica napus , была способна расщеплять потенциальные промежуточные продукты биосинтеза, также использовались другие неприродные субстраты, что позволяет предположить присутствие нескольких ферментов (Kiddle et al., 1999). Замена сульфгидрильной группы цистеина и расщепление C-S-лиазой имеет очевидные параллели с ароматической системой Allium , которую можно было бы исследовать.

Заключительные замечания

Таким образом, понимание биосинтеза ароматизаторов в Allium s является захватывающим моментом. Биосинтетический путь, предложенный Ланкастером и его коллегами, обеспечил жизненно важную основу для интеграции результатов исследований на срезах тканей, культуре тканей и интактных растениях, хотя взаимосвязь между CSO и γGP до сих пор полностью не решена.Исследования эффектов серного питания дополнили современные знания о поведении каждого предшественника вкуса. Накапливается информация, позволяющая предположить, что биосинтез MCSO и, возможно, каждого предшественника аромата может регулироваться по-разному и может не идти одним и тем же путем во всех физиологических условиях. Пониманию этой интригующей области вторичного метаболизма будет способствовать растущее знание метаболизма глутатиона и цистеина в других растениях, в частности Arabidopsis thaliana , что дает параллели для исследования.Следующим этапом будет идентификация и изучение большего количества ферментов и генов в Allium s, которые участвуют в биосинтезе предшественников вкуса. Цистеинсинтазы являются очевидными мишенями, как и ферменты метаболизма глутатиона. Неуловимые источники характерных алк (ен) ильных групп Allium остаются неизвестными, и их идентификация является одновременно проблемой и целью.

Мы благодарны за обсуждение с коллегами и финансовую поддержку проекта ЕС «Чеснок и здоровье», QLK1-CT-1999-00498.

Список литературы

Анкри С., Мирельман Д.

1999

Микробы и инфекции

1

125

Bacon JR, Moates GK, Ng A, Rhodes MJC, Smith AC, Waldron KW.

1999

Пищевая химия

64

257

Блок E.

1992

Angewandte Chemie

31

1135

Brodnitz MH, Pascale СП.

1971

Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии

19

269

Cai XJ, Uden PC, Block E, Zhang X, Quimby BD, Sullivan JJ.

1994

Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии

42

2081

Ceci LN, Curzio OA, Pomilio AB.

1992

Фитохимия

31

441

Коулман Джод, Блейк-Калфф ММА, Дэвис ТГЭ.

1997

Тенденции в растениеводстве

2

144

Коли-Смит младший.

1986

Патология растений

35

362

Collin HA.

2001

Положение о выращивании растений

34

119

Coolong TW, Randle WM.

2003

Журнал продовольственной науки и сельского хозяйства

83

477

Coolong TW, Randle WM.

2003

Журнал Американского общества садоводческих наук

128

776

Дэви М.Р., Маккензи И.А., Фриман Г.Г., Шорт К.С.

1974

Письма о растениеводстве

3

113

Эрншоу DM, McDonald MR, Boland GJ.

2000

Канадский журнал патологии растений

22

387

Эдвардс SJ, Бриттон G, Collin HA.

1994

Ткани и культура клеток растений

38

181

Ellis DR, Salt DE.

2003

Текущее мнение по биологии растений

6

273

Ellmore GS, Feldberg RS.

1994

Американский журнал ботаники

81

89

Fahey JW, Zalcmann AT, Talalay P.

2001

Фитохимия

56

5

Фенвик Дж., Хэнли А.

1985

Критические обзоры пищевой науки и питания

22

199

Gmelin R, Huxa H-H, Roth K, Höfle G.

1976

Фитохимия

15

1717

Гранрот Б.

1970

Annales Academiae Scientiarum Fennicae

154

1

Gutierrez-Alcala G, Gotor C, Meyer AJ, Fricker M, Vega JM, Romero LC.

2000

Proceedings of the National Academy of Sciences, USA

97

11108

Hanum T, Sinha NK, Cash JN.

1995

Журнал пищевой биохимии

19

51

Икегами Ф, Итагаки С., Муракоши И.

1993

Фитохимия

32

31

Икегами Ф, Муракоши И.

1994

Фитохимия

35

1089

Имаи С., Цуге Н., Томотаке М., Нагатом Й., Савада Х., Нагата Т., Кумагаи Х.

2002

Природа

419

685

Иноуэ К., Нодзи М., Сайто К.

1999

Европейский журнал биохимии

266

220

Киддл Джорджия, Беннетт Р.Н., Хик А.Дж., Уоллсгроув, РМ.

1999

Завод, клетки и окружающая среда

22

433

Кинг Дж. Дж., Брейдин Дж. М., Барк О., Маккаллум Дж. А., Хавей М. Дж..

1998

Теоретическая и прикладная генетика

96

52

Kopsell DE, Randle WM, Eiteman MA.

1999

Журнал Американского общества садоводческих наук

124

1777

Кубек Р., Ким С., МакКеон Д.М., Муса Р.А.

2002

Journal of Natural Products

65

960

Кубец Р., Ким С., Велишек Дж., Муса Р.А.

2002

Фитохимия

60

21

Кубец Р., Муса РА.

2001